達(dá)格列凈對(duì)肺動(dòng)脈高壓致右心衰竭大鼠房性心律失常的影響及機(jī)制

吳金春，劉 韜，崔 博，范致星，張 偉，羅俊苗，唐艷紅，吳 鋼，黃 鶴，黃從新

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，2.武漢大學(xué)心血管病研究所，3.心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060；4.青海省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，青海 西寧 810007)

右心衰竭(right heart failure，RHF)是多種原因?qū)е掠倚氖沂湛s和(或)舒張功能不全，進(jìn)而引起心排血量下降和循環(huán)障礙的一類臨床綜合征，其中肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)為常見病因。RHF時(shí)，由于右心壓力及容量負(fù)荷明顯增加，引起心房重構(gòu)、自主神經(jīng)和內(nèi)分泌失衡，導(dǎo)致RHF容易合并各種房性心律失常(atrial tachyarrhythmia，AT)[1]。達(dá)格列凈(dapagliflozin，DAPA)是鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2型抑制劑(Sodium Glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i)中的一種代表性藥物，已被證明除降糖作用之外，兼有改善心功能、抗炎、抑制心律失常等多種心血管保護(hù)作用[2]。新近研究表明，SGLT2i具有降低PAH及右心室重塑，降低心衰后心律失常發(fā)生，同時(shí)可能具有抗纖維化等作用[3]，而PAH后的心律失常與炎癥、纖維化及心臟電重構(gòu)密切相關(guān)[4]。DAPA是否能夠通過(guò)抑制炎癥及纖維化來(lái)改善PAH致RHF后的心房重構(gòu)，降低RHF相關(guān)AT易感性目前無(wú)相關(guān)報(bào)道，其可能機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠RHF模型，以DAPA進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)模型評(píng)估、炎癥檢測(cè)、心房纖維化評(píng)價(jià)，綜合分析炎癥及纖維化改變對(duì)模型大鼠心臟電生理特征的影響，旨在探討DAPA對(duì)RHF大鼠AT易感性影響及可能機(jī)制，為探究DAPA的心血管保護(hù)機(jī)制做進(jìn)一步的研究補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組60只♂ SD大鼠，(190～210)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)小動(dòng)物房[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2020-0027]，環(huán)境溫度為20～25 ℃，濕度為50%～70%，12 h明暗循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后稱重并隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(CTL)、模型組(MCT)、模型組+低劑量DAPA干預(yù)組(MCT+LD)和模型組+高劑量DAPA干預(yù)組(MCT+HD)。CTL組給予單次生理鹽水0.5 mL腹腔注射，其它3組根據(jù)既往研究給予無(wú)水酒精溶解的野百合堿(monocrotaline，MCT)單次腹腔注射(60 mg·kg-1)形成PAH，并逐漸進(jìn)展成RHF[5]。造模d 2起，MCT+LD組和MCT+HD組分別接受干預(yù)藥物(DAPA，1或3 mg·kg-1·d-1，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20170040)灌胃，CTL組和MCT組給予等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)干預(yù)35 d。本實(shí)驗(yàn)由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)實(shí)施，WDRM動(dòng)(福)第20201211號(hào)。

1.2 超聲心動(dòng)圖檢查大鼠稱重(每組5只)，以2%異氟醚麻醉，使用高頻單晶探頭彩色超聲心動(dòng)圖儀(VINNO，蘇州)評(píng)估大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。測(cè)量指標(biāo)：右心室橫徑(RV-width)、右心室長(zhǎng)徑(RV-length)、肺動(dòng)脈直徑(PAD)、肺動(dòng)脈加速時(shí)間(PAAT)、三尖瓣環(huán)平面收縮壓偏移(TAPSE)、右心室面積變化分?jǐn)?shù)(RVFAC)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。上述心臟超聲指標(biāo)測(cè)量由同一位超聲專業(yè)醫(yī)師操作完成，結(jié)果取自5個(gè)心動(dòng)周期下獲得的平均值。

1.3 右心導(dǎo)管測(cè)量肺動(dòng)脈高壓(PAP)及標(biāo)本取材大鼠(每組5只)以3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉并肝素化(400 U)，將肝素鹽水液沖洗的2 F聚乙烯(PE)導(dǎo)管連接換能器至Power Lab多道電生理記錄儀并較零，Lab Chart 8.0軟件同步記錄體表心電圖及壓力波形曲線。參照既往研究方法[6]，經(jīng)右心導(dǎo)管測(cè)量并分析平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)和平均右心室壓(mRVP)。測(cè)壓完成后，大鼠斷頸處死，開胸游離心臟，經(jīng)下腔靜脈取血液樣本2 mL，分離剪取右心房組織。血液離心制備成血清至-80 ℃冰箱冷凍保存，右心房組織以4%多聚甲醛固定并石蠟包埋。

1.4 血液學(xué)指標(biāo)分析酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清心房腦鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、白介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，以此評(píng)估大鼠心功能及炎癥反應(yīng)狀態(tài)。

1.5 組織學(xué)分析將右心房組織石蠟塊切割成4 μm切片，常規(guī)脫蠟，采用HE染色觀察右心房心肌細(xì)胞肥大情況，Masson三色染色檢測(cè)右心房纖維化，并用圖像分析軟件(Image-pro plus 6.0)計(jì)算右心房膠原體積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，以此評(píng)估纖維化程度。

1.6 在體心臟電生理研究

1.6.1右心房微電極陣列芯片記錄分析 大鼠(每組5只)以3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定連接體表心電圖，氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)并給予機(jī)械通氣(70次·min-1)。于左側(cè)第三肋間隙水平開胸，然后逐層鈍性分離直至暴露心臟，連接Power Lab多道電生理記錄儀，Lab Chart 8.0軟件同步記錄體表心電圖。參照既往研究方法[7]，將MEA 256生理記錄儀(Muti Channel Systems，Germany)記錄電極片貼敷于右心房處并固定(3×3)mm，電極記錄信號(hào)經(jīng)過(guò)放大器放大后由Cardio 2D軟件記錄，進(jìn)一步由Cardio 2D+軟件分析右心房激動(dòng)傳導(dǎo)速度(conduction velocity，CV) 。

1.6.2心臟電生理指標(biāo)測(cè)定 記錄分析體表心電圖指標(biāo)：P波時(shí)限、P波振幅、PR間期、QRS波間期、QT間期；在體心臟電生理指標(biāo)：心房間傳導(dǎo)時(shí)間(interatrial conduction time，IACT)、心房有效不應(yīng)期(atrial effective refractory period at 150 ms，AERP150，S1=150 ms)、心房動(dòng)作電位時(shí)程復(fù)極90%的時(shí)限(action potential duration 90%，APD90%)、AERP/APD比值、AT誘發(fā)率(atrial tachyarrhythmia inducibility，ATI)、平均AT持續(xù)時(shí)間(mean atrial tachyarrhythmia duration，MATD)。AT指左心房burst刺激，在右心房記錄到的房顫、房撲或房速，且持續(xù)時(shí)間超過(guò)1 s的快速性房性心律失常。ATI為每組AT誘發(fā)成功的大鼠與該組所有大鼠的比值，MATD為每只大鼠誘發(fā)AT起始至終止出現(xiàn)竇性心律的時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟結(jié)構(gòu)功能評(píng)價(jià)結(jié)果Fig 1A顯示了4組大鼠代表性的經(jīng)胸骨旁短軸4腔心M型超聲圖像，F(xiàn)ig 1B顯示了4組大鼠經(jīng)右心導(dǎo)管測(cè)量PAP的波形圖像。與CTL組相比，MCT組mPAP明顯升高(18.94±2.13 mmHgvs51.75±4.53 mmHg，P<0.05)，mRVP明顯升高(11.72±1.72 mmHgvs36.77±1.90 mmHg，P<0.05)ANP水平明顯升高(244.99±27.66 ng·L-1vs649.04±53.75 ng·L-1，P<0.05)，RV-width增加(4.56±0.29 mmvs5.84±0.16 mm，P<0.05)、RV-length增加(9.50±0.60 mmvs11.41±0.16mm，P<0.05)、PAD增加(2.15±0.07 mmvs3.70±0.18 mm，P<0.05)、PAAT增加(36.25±3.07 msvs21.4±2.41 ms，P<0.05)、Tapes增加(2.96±0.16 mmvs2.21±0.12 mm，P<0.05)、RVFAC降低(0.45%±0.03%vs0.27%±0.12%，P<0.05)，而LVEF無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(81.3%±3.08%vs83.42%±3.07%P>0.05)，提示大鼠RHF模型造模成功。然而，經(jīng)DAPA干預(yù)后，MCT+LD組mPAP較RHF組下降(40.94±3.53 mmHgvs51.75±4.53 mmHg，P<0.05)，mRVP下降(30.14±2.68 mmHgvs36.77±1.90 mmHg，P<0.05)，ANP下降(459.66±25.19 ng·L-1vs649.04±53.75 ng·L-1，P<0.05)，其余超聲指標(biāo)提示右心功能有所改善，且高劑量DAPA干預(yù)較低劑量DAPA干預(yù)后右心改善效果明顯(Tab 1)。

Fig 1 Ultrasound and hemodynamics assessment of four groups of rats

Tab 1 Results of hemodynamic and cardiac structural and functional evaluation in four experimental groups of

2.2 4組大鼠血清炎癥指標(biāo)結(jié)果與CTL組相比，MCT組IL-1β(17.41±3.94 ng·L-1vs90.36±10.84 ng·L-1)、IL-6(16.31±3.95ng·L-1vs71.09±10.75 ng·L-1)、TNF-α(20.31±3.51 ng·L-1vs224.44±19.83 ng·L-1)、hs-CRP(3 221.57±707.84 ng·L-1vs11 045.6±1 835.51 ng·L-1)明顯升高(全P<0.05)，經(jīng)DAPA干預(yù)后，MCT+LD組與MCT+HD組炎癥指標(biāo)IL-1β(56.26±5.40 ng·L-1vs38.02±4.31 ng·L-1)、IL-6(36.38±4.10 ng·L-1vs25.88±4.01 ng·L-1)、TNF-α(135.75±15.13 ng·L-1vs52.05±7.98 ng·L-1)、hs-CRP(6 295.65±464.60 ng·L-1vs4 483.58±441.64 ng·L-1)均下降，且下降程度與DAPA劑量相關(guān)(P<0.05)(Tab 2)。

Tab 2 Serum inflammation indicators in four groups of

2.3 4組大鼠心房組織學(xué)結(jié)果Fig 2A顯示了4組大鼠右心房組織HE染色及Masson三色染色示例圖片及相關(guān)分析。在心房肌組織HE染色切片中，CTL組心肌橫紋清晰，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小、形態(tài)基本一致，胞質(zhì)染色均勻，MCT組可見心肌橫紋肥大疏松，心肌細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)破壞，部分心肌橫紋消失，DAPA干預(yù)后上病理改變明顯減輕，且MCT+HD組改善情況優(yōu)于MCT+LD組。在心房肌組織Masson三色染色中，CTL組可見心肌細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞呈紅色，幾乎無(wú)藍(lán)色標(biāo)記的膠原纖維，MCT組可見心肌細(xì)胞排列紊亂，大量心肌細(xì)胞被藍(lán)色膠原纖維包繞，MCT+LD組可見散在藍(lán)色標(biāo)記的膠原纖維，MCT+HD組藍(lán)色標(biāo)記的膠原纖維減少(Fig 2B)。右心房CVF分析提示DAPA能夠改善RHF后的右心房纖維化(MCT：5.60%vsCTL：0.57%)，且高劑量干預(yù)改善效果更加明顯(MCT+LD：2.82%vsMCT+HD：1.56%)(P<0.05)(Fig 2C)。

Fig 2 Characteristics of histological changes and analysis of atria in four groups of rats

2.4 4組大鼠微電極陣列芯片分析結(jié)果Fig 3A為微電極陣列記錄右心房單向動(dòng)作電位示意圖。CV測(cè)量中，CTL組右心房CV較快且傳導(dǎo)均一，MCT組CV較CTL組明顯減慢且傳導(dǎo)明顯不均一(41.33 cm·s-1vs22.17 cm·s-1)(P<0.05)，DAPA干預(yù)組CV及傳導(dǎo)均一性改善(P<0.05)，且高劑量組改善更明顯(MCT+HD：31.83 cm·s-1vsMCT+LD：26.67 cm·s-1)，但高、低劑量組間CV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(Fig 3B)。

Tab 3 ECG and cardiac electrophysiological parameters in four groups of rats

Fig 3 The MEA analysis and electrophysiological characterization of four groups of rats

2.5 4組大鼠在體電生理測(cè)定結(jié)果Tab 3匯總了4組大鼠在體電生理測(cè)定結(jié)果。與CTL組比較，MCT組QT間期延長(zhǎng)(55.43±4.28 msvs91.71±3.45 ms，P<0.05)、IACT150延長(zhǎng)(16.08±1.93 msvs27.42±4.27 ms，P<0.05)、AERP150延長(zhǎng)(27.50±4.19 msvs40.50±3.92 ms，P<0.05)、APD90%延長(zhǎng)(38±3.42 msvs47±4.38 ms，P<0.05)，而HR、P波時(shí)限、PR間期、QRS波間期在4組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)過(guò)DAPA干預(yù)后，IACT150(27.42±4.27 msvs19.08±2.07 ms)、AERP150(40.50±3.92 msvs32.00±2.62 ms)、APD90%(47±4.38 msvs42±3.59 ms)(P<0.05)縮短，APD90%在不同劑量DAPA干預(yù)組間有變化趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(MCT+LD：45±2.47 msvsMCT+HD：42±3.59 ms)(P>0.05)。AERP/APD比值在MCT組間最低，提示AERP相對(duì)縮短，DAPA干預(yù)后該比值增加，但4組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 4組大鼠AT易感性檢測(cè)結(jié)果Fig 3C為4組大鼠代表性的AT誘發(fā)圖，F(xiàn)ig 3D為4組大鼠的MATD。CTL組未誘發(fā)出AT，MATD為0 s，而MCT組中9只誘發(fā)出AT，MATD為9.72 s(P<0.05)。經(jīng)過(guò)DAPA干預(yù)后，MCT+LD組中4只誘發(fā)出AT，MATD為6.45 s(vsMCTP<0.05)，MCT+HD組中2只誘發(fā)出AT，MATD為3.55 s(vsMCTP<0.05)，而DAPA干預(yù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步計(jì)算4組大鼠ATI，CTL組為0%，MCT組為80%，MCT+LD組較MCT組降低了40%，MCT+HD組ATI較MCT組降低了60%(P<0.05)(Fig 3E)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MCT腹腔注射形成PAH并誘導(dǎo)形成RHF。MCT是雙吡咯類生物堿，進(jìn)入體內(nèi)可引起肺血管不可逆性損傷而引起PAH，目前已廣泛應(yīng)用于人類PAH的替代動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)用藥，其方法簡(jiǎn)便可行，成功率高，重復(fù)性好[8]。既往研究表明[5]，大鼠單次腹膜內(nèi)注射MCT后21 d后即可形成PAH。隨著PAH進(jìn)展，右心壓力超負(fù)荷，導(dǎo)致心臟出現(xiàn)代償性向心性肥大，當(dāng)超負(fù)荷持續(xù)存在時(shí)，出現(xiàn)失代償性離心性肥大，并逐漸出現(xiàn)心功能不全，一般4～5周即可形成PAH后的RHF。我們實(shí)驗(yàn)中觀察到，與CTL組相比，MCT組大鼠1周左右逐漸出現(xiàn)體重減輕、厭食、寒冷、毛發(fā)豎立和嗜睡等表現(xiàn)，5周時(shí)超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)提示PAP和RVP明顯升高，右心擴(kuò)大，取材時(shí)可見有多漿膜腔積液和肝臟、肺臟明顯充血，心臟病理組織切片等提示右心肥大及纖維化病變，提示我們實(shí)驗(yàn)中RHF模型建立成功。

本研究發(fā)現(xiàn)，DAPA可以抑制心房纖維化。既往研究表明[9]，心臟纖維化是大多數(shù)心肌疾病的常見病理改變，纖維化早期可能對(duì)心臟具有一定的保護(hù)作用，但長(zhǎng)時(shí)間的纖維化通常會(huì)導(dǎo)致收縮和舒張功能障礙，心臟結(jié)構(gòu)、電傳導(dǎo)及興奮性改變，另外心肌組織ERP、APD、膜上離子通道蛋白表達(dá)等也會(huì)受到纖維化的影響，形成心電傳導(dǎo)阻滯及微折返，引起心律失常。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CTL組比較，MCT組右心房心肌細(xì)胞肥大，CVF明顯高于CTL組，提示MCT組有明顯纖維化改變，給予DAPA干預(yù)后，心肌細(xì)胞縮小，排列趨于整齊，纖維化指標(biāo)減低，提示DAPA具有改善心房纖維化的作用，且高劑量改善作用明顯。進(jìn)一步電生理檢查發(fā)現(xiàn)，MCT組右心房CV降低，ATI、MATD明顯增加，然而DAPA干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)以上改變。綜合以上分析，我們認(rèn)為DAPA可能通過(guò)改善心房纖維化而能降低RHF大鼠AT易感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，DAPA可以改善RHF大鼠炎癥反應(yīng)。既往研究表明[4]，炎癥是PAH形成的重要因素，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中前一周為急性炎癥期，之后炎癥持續(xù)存在并進(jìn)展為慢性炎癥，隨著后期心功能下降，炎癥激活更加明顯。而炎癥與AT的發(fā)生密切相關(guān)，新近研究也表明，炎癥具有促進(jìn)心房纖維化和增加ATI的作用[10-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CTL組比較，MCT組血清炎癥指標(biāo)明顯升高，經(jīng)過(guò)DAPA干預(yù)后，MCT+LD組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、hs-CRP炎癥標(biāo)志物含量有所下降，MCT+HD組下降更明顯，同時(shí)，DAPA干預(yù)組右心房CV升高，ATI、MATD下降，因此，推測(cè)DAPA還可能通過(guò)抑制炎癥而降低RHF大鼠AT易感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，DAPA改善了RHF大鼠心房電重構(gòu)特征。既往研究表明[12-13]，心房電重構(gòu)與AT的發(fā)生和維持有關(guān)，如P波時(shí)限延長(zhǎng)、IACT延長(zhǎng)和AERP縮短等，其中P波時(shí)限延長(zhǎng)和IACT延長(zhǎng)提示心房電傳導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，心房易損期增加，易于發(fā)生延遲后除極及折返，進(jìn)而發(fā)生心律失常。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CTL組比較，MCT組IACT150延長(zhǎng)，ATI也增加，DAPA干預(yù)后IACT150縮短，ATI有降低趨勢(shì)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，MCT組AERP和APD較CTL組延長(zhǎng)，而ERP改變?cè)谛穆墒С５陌l(fā)生中起到關(guān)鍵作用，ERP縮短，折返越易于形成，進(jìn)而發(fā)生心律失常。仔細(xì)分析后我們認(rèn)為，RHF大鼠心房ERP和APD延長(zhǎng)可能與纖維化和炎癥激活相關(guān)，纖維化發(fā)生時(shí)成纖維細(xì)胞增殖并分化為分泌性成纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞被纖維組織鞘包饒，心電傳導(dǎo)延緩，導(dǎo)致APD和ERP延長(zhǎng)，此外，我們研究還發(fā)現(xiàn)AERP/APD比值在MCT中最低，即AERP相對(duì)縮短，然而DAPA干預(yù)后該比值增加，即AERP相對(duì)延長(zhǎng)，可能導(dǎo)致干預(yù)組ATI降低，MATD縮短，即AT易感性降低，相關(guān)研究也支持我們的這一推斷[14-15]。除此之外，既往研究認(rèn)為[16]，MCT模型大鼠心肌Cx43表達(dá)明顯減低，其主要原因考慮與PAH后的心肌纖維化相關(guān)，而DAPA干預(yù)可以通過(guò)改善纖維化而起到抑制Cx43降解的作用[17]，因此，我們推測(cè)DAPA還可能通過(guò)抑制Cx43降解而抑制RHF大鼠AT的發(fā)生，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DAPA通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和抗心房纖維化而降低PAH致RHF大鼠的AT易感性。