孕婦外周血微小RNA異常表達譜的鑒定及對妊娠期糖尿病的診斷價值研究

鐘新麗，何秋，朱紅霞

在過去的20年里，妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）在中國人口中的發(fā)病率已經(jīng)上升至17.5%～18.9%，成為一個重要的公共衛(wèi)生問題［1］。GDM會對胎兒及其母親造成長期的健康損傷［2］，據(jù)報道，患有GDM的孕婦易患先兆子癇，高達70%的GDM婦女會在分娩后發(fā)生2型糖尿病和心血管疾?。?］。GDM的發(fā)病機制復(fù)雜且未完全闡明［4］。最近的研究表明，孕婦外周血中miRNAs的異常表達與GDM的發(fā)生有關(guān)，但關(guān)于特異性miRNAs種類尚未達成一致［5］。miRNAs既存在于細胞質(zhì)中，也存在于細胞外基質(zhì)中［6］。雖然外周血miRNAs的確切效應(yīng)尚不清楚，但有研究者發(fā)現(xiàn)，胎盤分泌miRNAs前體進入外周血液，由于miRNAs在體液中高度穩(wěn)定，因此，外周血miRNAs可作為多種疾病的候選生物標(biāo)志物［7］。目前，GDM的診斷依賴于口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），但此項檢查流程較多，需要禁食和多次抽血，惡心和嘔吐等不良反應(yīng)也會導(dǎo)致病人依從性下降［8］。因此，尋找新的GDM生物標(biāo)志物，可能為GDM的早期診斷和輔助診斷提供線索［9］。在本研究中，我們鑒定了GDM病人外周血中差異表達的miRNAs，評估驗證了miRNAs的靶基因與代謝途徑和生物學(xué)過程之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年1月至2020年2月成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院收治的62例妊娠晚期（妊娠26～40周）糖尿病病人為研究對象（GDM組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡范圍24～40歲。（2）單胎妊娠。（3）均經(jīng)OGTT試驗確診為GDM。（4）首次妊娠。（5）孕婦及其近親屬對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕前糖尿病、高血壓病人。（2）多胎妊娠。（3）合并先兆早產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長受限、前置胎盤和其他妊娠相關(guān)并發(fā)癥。（4）臨床資料不完全。同時，選擇同期我院收治的年齡匹配、糖耐量正常的62例孕婦為糖耐量正常（NGT）組。GDM組給予飲食和運動療法，血糖高于目標(biāo)值者，皮下注射胰島素，直至血糖恢復(fù)正常，血糖控制目標(biāo)為空腹血糖＜5.3 mmol∕L，餐后1 h血糖＜7.8 mmol∕L，餐后2 h血糖＜6.7 mmol∕L。所有孕婦均抽取靜脈血5 mL，輕輕將全血滴入潔凈的EP管，4℃下靜置4 h。在4 000 g、4℃條件下離心10 min，上層為淡黃色血清，吸出上清后再在1 500 g、4℃條件下離心10 min，以最大程度保證血清質(zhì)量，分裝血清，凍存于-80℃冰箱。所有收獲的血液樣品均在-80℃下超低溫保存。本研究使用的臨床資料來自門診和住院病歷。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 最新高通量測序檢測使用NanoPhotometer?分光光度計、Qubit?2.0熒光光度計和Agilent 2100 RNA Nano 6000分析試劑盒從 等GDM組 和NGT組孕婦外周血中提取總RNA。使用NextSeq測序平臺上的SE50測序程序?qū)细竦腄NA文庫進行測序，以獲得高質(zhì)量的序列讀數(shù)。通過Bowtie對數(shù)據(jù)進行清理并與參考基因組進行比對，并使用miRDeep2軟件鑒定miRNAs。DESeq分析得到差異表達的miRNAs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Q＜0.05，|log2foldYchange|＞1。

1.3 RNA提取及RT-PCR檢測根據(jù)制造商的說明，提取總外周血RNA。互補脫氧核糖核酸是用MMul V逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 在 凸 環(huán)miRNA-144∕125b∕543∕15b∕451∕U6 miRNA RT引物（中國廣東廣州RiboBio）的作用下合成的。定量聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR）使用SYBR試劑在CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)上進行，PCR反應(yīng)重復(fù)三次。PCR反應(yīng)條件為95℃變性20 s，然后95℃變性10 s，60℃變性20 s，70℃變性10 s，共40個循環(huán)。用U6對qPCR數(shù)據(jù)進行歸一化處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件包和Weka 3.6數(shù)據(jù)挖掘軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料采用單樣本Kolmogorov-Smirnov法檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)表示，采用χ2檢驗。采用逐步logistic回歸多因素分析篩選孕期血糖水平升高的因素。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期糖尿病病人外周血中miRNAs的差異表達與NGT組相比，GDM組孕婦外周血共檢測到157個差異表達的miRNAs，其中114個上調(diào)，43個下調(diào)（圖1a）。層級聚類（圖1b）顯示GDM組與NGT組的miRNA圖譜明顯不同，其中8個miRNAs顯著上調(diào)，6個miRNAs下調(diào)（P＜0.05）。

2.2 妊娠期糖尿病和非妊娠期糖尿病病人外周血中差異表達miRNAs的驗證利用qPCR驗證在外周血中高表達且最可能與能量代謝相關(guān)的差異表達的miRNAs。選取5個miRNAs，即miRNA125b、miRNA-543、miRNA-144、miRNA-15b和miRNA-451在GDM組和NGT組孕婦外周血組織中進行qPCR驗證。qPCR結(jié)果顯 示，NGT組、GDM組miRNA-125b的相對表達水平分別為5.83±1.31、1.34±0.30（t=26.31，P＜0.001），miRNA-543的相對表達水平分別為0.93±0.21、0.22±0.06（t=25.60，P＜0.001），miRNA-144的相對表達水平分別為0.42±0.19、1.32±0.28（t=20.94，P＜0.001），miRNA-125b、miRNA-543和miRNA-144的表達水平與最新高通量測序結(jié)果一致（P＜0.05）。兩組間miRNA-15b和miRNA-451的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 miRNA-125b和miRNA-144在外周血中的表達應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測GDM組和NGT組孕婦血漿中miRNA-144和miRNA-125b的表達水平。糖化血紅蛋白（HbA1c）和血糖水平，在所有三個時間點，GDM組均顯著高于NGT組（P=0.499）。與NGT組相比，GDM組孕前體質(zhì)量明顯增加，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、分娩前舒張壓、血小板水平明顯升高。與非妊娠期糖尿病孕婦相比，妊娠期糖尿病孕婦外周血中miRNA-125b表達下調(diào)（P＜0.001），miRNA-144表達上調(diào)（P＜0.001）。表1。

表1 兩組孕婦臨床特征比較

表1 兩組孕婦臨床特征比較

注：OGTT為口服葡萄糖耐量試驗，HbA1c為糖化血紅蛋白，BMI為體質(zhì)量指數(shù)。

指標(biāo)OGTT 0 h∕（mmol∕L）OGTT 1 h∕（mmol∕L）OGTT 2 h∕（mmol∕L）HbA1C∕%年齡∕歲分娩時的妊娠時間∕d體質(zhì)量∕kg孕期體質(zhì)量增加∕kg孕前BMI∕（kg∕m2）孕期BMI增加∕（kg∕m2）收縮壓∕mmHg舒張壓∕mmHg白細胞計數(shù)∕（×109∕L）淋巴細胞百分比∕%中性粒細胞∕淋巴細胞比血紅蛋白∕（g∕L）血小板計數(shù)∕（×109∕L）腹圍∕cm新生兒體質(zhì)量∕g miRNA-125b miRNA-144 NGT組（n=62）4.46±0.40 6.76±2.54 5.79±1.12 5.13±0.36 30.54±5.74 277.98±9.63 58.76±11.25 16.52±4.43 22.32±3.84 6.28±1.83 125.36±9.25 77.52±5.63 9.46±2.33 20.65±5.24 4.35±3.56 115.63±12.84 242.64±53.14 104.65±8.36 3 418.99±436.25 2.38±1.26 0.73±0.46 GDM組（n=62）5.23±0.59 11.20±1.42 9.23±1.84 5.69±0.53 32.54±4.78 279.65±10.52 65.87±11.02 14.23±5.11 25.14±4.23 5.95±1.76 128.65±10.32 84.32±8.93 8.94±2.24 19.65±5.00 4.49±3.02 114.88±13.04 213.52±48.79 105.68±7.74 3 769.36±536.22 0.54±0.79 2.98±1.35 t值-8.51-12.01-12.57-6.88-2.11-0.92-3.55 2.67-3.89 1.02-1.87-5.07 1.27 1.09-0.24 0.32 3.18-0.71 30.18 9.74-12.42 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.037 0.358 0.001 0.009＜0.001 0.308 0.064＜0.001 0.208 0.279 0.814 0.747 0.002 0.478＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 miRNA-144、miRNA-125b與臨床參數(shù)的相關(guān)性在妊娠期間（r=-0.33，P=0.018）和分娩前（r=-0.29，P=0.039），miRNA144的表達與BMI呈負相關(guān)，而與血小板數(shù)量（r=0.31，P=0.028）和餐后1 h血糖水平呈正相關(guān)（r=0.28、P=0.044）。miRNA-125b與妊娠期糖尿病呈負相關(guān)（r=-0.91，P＜0.001），而miRNA-144和孕前BMI與妊娠期糖尿病呈正相關(guān)（r=0.89、0.30，P＜0.001，P=0.033）。圖2。

圖2 miRNA-144、miRNA-125b與妊娠期糖尿病臨床參數(shù)的相關(guān)性

2.5 影響GDM發(fā)病的危險因素分析多因素分析結(jié)果顯示，miRNA-125b、miRNA-144和孕前BMI是影 響GDM發(fā) 病 的 獨 立 性 危 險 因 素（P＜0.05）。見表2。

表2 影響妊娠期糖尿病發(fā)生的危險因素分析

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-125b和miRNA-144在外周血大量表達，且二者是影響GDM發(fā)病的獨立性危險因素。GDM孕婦外周血中miRNA-125b和miRNA-144明顯改變，可作為妊娠期糖尿病的潛在生物標(biāo)志物。此外，與研究報告一致的是，BMI高的肥胖女性患妊娠期糖尿病的風(fēng)險明顯更高，孕前BMI是一個容易測量的臨床因素，與妊娠期糖尿病的發(fā)病率呈正相關(guān)［10］。

miRNA-125b是miRNA-125家族的成員。miRNA-125不是孕婦外周血特異性miRNA，胰腺和中樞神經(jīng)細胞中的β細胞也分泌miRNA-125［11］。有研究表明，妊娠期miRNA-125水平明顯升高。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)miRNA-125b在外周血中高表達。然而，研究發(fā)現(xiàn)妊娠晚期GDM病人血清miRNA-125水平無明顯差異，這與本研究結(jié)果不一致。這可能是由于病人特征、實驗方法和組織的不同造成的。有研究者發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，2型糖尿病病人和肥胖男性病人外周血中miRNA-125b的水平顯著降低，這與本研究的結(jié)果一致，其中，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-125b的表達下降與GDM發(fā)病顯著相關(guān)［12］。最近的研究表明，miRNA-125b的低表達可能通過增加c-maf轉(zhuǎn)錄本的表達而促進高血糖［13］，并抑制人去乙?；窼irtuin-7的表達。研究結(jié)果提示，miRNA-125b的低水平表達與糖代謝異常有關(guān)。本研究的靶基因功能富集分析結(jié)果表明，miRNA-125b可能通過能量代謝途徑影響血糖代謝。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-144在糖尿病病人血液中表達上調(diào)，并且在1型、2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人中表達失調(diào)［14］。我們的研究還表明，在妊娠晚期，妊娠期糖尿病病人血漿外切體中miRNA-144的表達顯著增加。miRNA-144直接靶向胰島素受體底物1（insulin receptor substrate，IRS1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運體（glucose Transporters，GLUT）［15］。IRS1高度參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，GLUT也可能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝［16］。然而，基于同一隊列的兩項研究表明miRNA-144與血糖水平呈負相關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病病人胎盤絨毛分泌的外體miRNA-144表達降低［17］。此外，盡管妊娠期糖尿病組孕婦在懷孕前和分娩前表現(xiàn)出更高的miRNA-144和BMI水平，但在本研究中，這兩個參數(shù)與妊娠期糖尿病的發(fā)病率呈顯著負相關(guān)。miRNA-144的異常表達與糖脂代謝密切相關(guān)，但從現(xiàn)有文獻中得出的結(jié)論是相互矛盾的，可能是由于種族、性別、實驗方法和樣本量的差異［18］。能量代謝與年齡、性別、BMI和不同的身體組織有關(guān)，因此其作用機制往往非常復(fù)雜［19］。miRNA-144在妊娠期糖尿病發(fā)病機制中的作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了新的妊娠期糖尿病生物標(biāo)志物，為妊娠期糖尿病的診斷方法和發(fā)病機制的研究提供了新的思路。但也存在一定的缺陷：（1）缺少隨訪研究來證實miRNA-125b和miRNA-144對妊娠早期和中期妊娠期糖尿病發(fā)病率的預(yù)測價值；（2）本研究采用病例對照研究方法，但由于妊娠期糖尿病的影響，兩組孕婦在體質(zhì)量、BMI等基線資料方面不可避免地存在一定的差異；（3）樣本量較少，且來自于單中心，可能存在一定的樣本偏倚。

（本文圖1見插圖1-4）