基于NOD樣受體熱蛋白結構域3/胱天蛋白酶-1通路探討魚腥草注射液緩解脂多糖誘導的小鼠急性肺炎肺損傷的作用機制

簡宇，范婷，代凌云，趙春虎

肺炎是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，多發(fā)病于兒童及年老體弱人群，其發(fā)病機制復雜，具有發(fā)病迅速、發(fā)展速度快、不易治療等特點，嚴重者可誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病，甚至危及生命［1］。近年來，肺炎發(fā)生率逐漸升高，給人們的生活和生命健康帶來嚴重威脅［2］。肺部持續(xù)炎性反應和感染是肺炎的主要病理形式之一［3］，而NOD樣受體熱蛋白結構域3（NLRP3）∕胱天蛋白酶-1（caspase-1）通路可促進炎性因子釋放，介導炎癥反應，并參與肺組織損傷過程［4-5］，因此NLRP3∕caspase-1通路分子在組織炎癥損傷過程的調控作用，也受到廣大學者的關注。中醫(yī)藥在治療肺炎方面有其獨特的優(yōu)勢，魚腥草注射液（HHI）具有清熱、解毒、利濕作用，臨床上常用于治療肺膿瘍、痰熱咳嗽、尿路感染等癥，近來研究發(fā)現，其在治療急性肺炎方面，具有較好的療效［6］，但HHI治療肺炎的具體分子生物學機制還不甚明確。本研究于2019年7月至2020年6月，用脂多糖（LPS）誘導建立小鼠肺炎模型，探究HHI對肺炎小鼠NLRP3∕caspase-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物同遺傳背景BALB∕c雄性小鼠，清潔級，4～6周齡，體質量20～25 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心［許可證號SCXK（粵）2018-0002］。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。。

1.1.2 主要試劑、儀器魚腥草注射液（河南利欣制藥股份有限公司，批號B201658，規(guī)格2毫升∕支）；蘇木精-伊紅染色（HE）染色試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司，貨號LMO105）；白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號LS-F37731）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司，貨號DMM57136）；NLRP3激動劑二乙基二硫代氨基甲酸酯（DDC）試劑（美國Sigma公司，貨號S-0319）；NLRP3抗 體（貨 號ab264468）、caspase-1抗 體（貨 號ab138483）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）抗體（貨號ab155970）、TNF-α抗體（貨號ab109322）、IL-6抗體（貨號ab229381），均購自美國abcam公司；總RNA軸提?。═rizol）試劑盒（貨號T6126）、反轉錄試劑盒（貨號T1597），均購自日本TAKARA；BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司，貨號P0768）。光學顯微鏡（貨號SMZ745，日本尼康公司）；凝膠成像儀（Miulab公司，型號GIS-500）；流式細胞分選儀（碧迪醫(yī)療器械有限公司，型號ACS AriaⅡ）；實時熒光定量PCR儀（德國Eppendorf艾本德，型號Mastercycler nexus X2）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、肺炎模型構建及給藥90只小鼠分為正常對照組、模型組、HHI低（10 mL∕kg）及高（30 mL∕kg）劑量組、NLRP3激動劑（二乙基二硫代氨基甲酸酯，DDC）組（300 mg∕kg）、HHI+DDC組（30 mL∕kg+300 mg∕kg），每組15只。除正常對照組外的各組小鼠均依據文獻［7］用霧化吸入LPS法構建肺炎模型：將小鼠裝入密閉盒中，用空氣壓縮機將壓縮后的空氣送到裝有LPS濃度為2.5 g∕L的塑料管中，啟動霧化器，將LPS霧化成為霧狀液體，并將霧化液體送入密閉盒中，持續(xù)霧化30 min即可。正常對照組小鼠僅霧化吸入0.9%的生理鹽水。造模后5 h，HHI低、高劑量組靜脈注射10 mL∕kg、30 mL∕kg的HHI［8］；DDC組灌胃給予10 mL∕kg DDC（用生理鹽水稀釋成30 g∕L的溶液）［9］；HHI+DDC組靜脈注射和灌胃給予30 mL∕kg的HHI和300 mg∕kg的DDC；模型組、正常對照組分別灌胃和靜脈注射等量生理鹽水。各組每天給藥1次，連續(xù)4 d。給藥期間觀察小鼠飲食、飲水、活動量等一般行為狀況。

1.2.2 標本采集末次給藥24 h后，每組按隨機數字表法選取5只小鼠，3%戊巴比妥鈉麻醉后開胸，對左主支氣管進行結扎，取左肺，于頸部分離氣管進行插管后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗右肺3次，每次1 mL，獲得支氣管肺泡灌洗液（BALF），將BALF離心分離后得上清液及細胞，備用，處死小鼠。剩余小鼠，麻醉后處死，取完整左右兩肺，右肺稱重后，置于80℃烘箱內烘烤72 h后，稱量干質量，計算濕∕干質量比值。剪取左肺0.5 g組織凍存?zhèn)溆?，剩余組織立即于4%多聚甲醛中固定24 h。

1.2.3 BALF中IL-6、TNF-α含量及中性粒細胞數目檢測取“1.2.2”中的BALF上清液，按IL-6、TNF-α試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α含量。取“1.2.2”中BALF離心后的細胞，參照文獻［9］進行混合流式抗體（CD45∕CD11b∕F4∕80∕Gr-1∕CD48）避 光 染 色15 min。用2 mL PBS溶液重懸絕對計數管（內含有已知數目的熒光微球）后，向每個樣本管內加入200 μL重懸液體，用流式細胞分選儀檢測BALF中中性粒細胞（CD45+CD11bhighGr-1high）及熒光微球百分比進行檢測。按公式：中性粒細胞數目=熒光微球數目∕熒光微球百分比×中性粒細胞百分比∕10，計算中性粒細胞數目。

1.2.4 肺組織HE染色對“1.2.2”中固定的肺組織進行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后，切成5 μm厚的切片，依據HE染色試劑盒說明書處理組織，在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.5 qRT-PCR檢測肺組織NLRP3 mRNA、ASC mRNA表達于4℃冰箱中解凍“1.2.2”中凍存的肺組織后，用Trizol試劑盒抽提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄互補DNA（cDNA）。然后使用RT-qPCR試劑盒（SYBR Green）和PCR儀進行擴增，共進行40個循環(huán)終止反應。NLRP3 mRNA、ASC mRNA以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算PNLRP3 mRNA、ASC mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 q-RT-PCR引物序列

1.2.6 蛋白質印跡法檢測肺組織NLRP3、ASCIL-6、caspase-1、IL-6、TNF-α蛋白相對表達水平用蛋白提取試劑盒提取“1.2.5”中剩余肺組織總蛋白，定量后，取50 μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入NLRP3（1∶1 000）、ASCIL-6（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗，4℃孵育過夜，加入HRP羊抗兔二抗（1∶2 000），37℃孵育1 h，采用增強化學發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學方法以SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，多組間兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般行為變化正常組小鼠毛色、飲食活動均正常。模型組小鼠毛色失去光澤，飲食活動量均減少，活動后小鼠有喘息聲，且小鼠有2只死亡。HHI低、高劑量組小鼠飲食活動量均較模型組有所增加，活動后喘息聲有所減少，且試驗過程中均無死亡。DDC組小鼠死亡4只，毛色枯槁，飲食活動減少及活動后喘息聲最嚴重。

2.2 各組小鼠肺組織病理損傷檢測結果正常對照組小鼠肺組織結構完整；模型組小鼠肺泡壁及間隔水腫、破壞、充血、炎癥細胞浸潤明顯，肺泡腔有紅細胞滲出；HHI低、高劑量組小鼠肺泡破壞、充血、炎癥細胞浸潤等病理損傷減輕，且HH高劑量組緩解效果優(yōu)于低劑量組；DDC組肺泡破壞、充血、炎性浸潤等病理現象最嚴重；HHI+DDC組肺泡病理損傷與模型組相近，見圖1。

2.3 各組小鼠W/D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA相對表達水平檢測結果模型組與正常對照組相比，右肺組織W∕D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA升高（P＜0.05）；HHI低、高劑量組與模型組相比，W∕D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA降低（P＜0.05），且有劑量依賴性；DDC組W∕D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA升高（P＜0.05）；模型組與HHI+DDC組相比，W∕D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠W∕D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA相對表達水平比較∕

表2 各組小鼠W∕D、NLRP3 mRNA、ASCmRNA相對表達水平比較∕

注：HHI為魚腥草注射液，DDC為二硫代氨基甲酸酯，W∕D為右肺濕重∕干重，NLRP3為NOD樣受體熱蛋白結構域3，ASC為凋亡相關斑點樣蛋白，β-actin為β肌動蛋白。①與正常對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與HHI+DDC組比較，P＜0.05。④與HHI低劑量組比較，P＜0.05。⑤與HHI高劑量組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組HHI+DDC組HHI低劑量組HHI高劑量組DDC組F值P值鼠數10 8 10 10 10 6 W∕D 4.01±0.22 6.06±0.26①6.05±0.25①5.58±0.24①②③5.03±0.23①②③④6.69±0.26①②③④⑤149.75＜0.001 NLRP3 mRNA∕β-actin 1.01±0.12 2.06±0.15①2.03±0.15①1.81±0.14①②③1.42±0.13①②③2.61±0.16①②③④⑤152.29＜0.001 ASC mRNA∕β-actin 1.02±0.14 2.04±0.16①2.02±0.16①1.79±0.15①②③1.41±0.14①②③2.69±0.17①②③④⑤139.96＜0.001

2.4 各組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平及中性粒細胞數目檢測結果模型組與正常對照組相比，IL-6、TNF-α水平及中性粒細胞數目增高（P＜0.05）；HHI低、高劑量組與模型組相比，IL-6、TNF-α水平及中性粒細胞數目下降（P＜0.05），且有劑量依賴性；DDC組IL-6、TNF-α水平及中性粒細胞數目升高（P＜0.05）；HHI+DDC組與模型組相比，IL-6、TNF-α水平及中性粒細胞數目差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組小鼠BALF中IL-6、TNF-α含量及中性粒細胞數目比較

表3 各組小鼠BALF中IL-6、TNF-α含量及中性粒細胞數目比較

注：HHI為魚腥草注射液，DDC為二硫代氨基甲酸酯，IL-6為白細胞介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與正常對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與HHI+DDC組比較，P＜0.05。④與HHI低劑量組比較，P＜0.05。⑤與HHI高劑量組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組HHI+DDC組HHI低劑量組HHI高劑量組DDC組F值P值鼠數5 5 5 5 5 5 IL-6∕（μg∕L）569.91±50.89 1 692.06±95.26①1 690.58±95.04①1 069.13±75.12①②③889.02±65.13①②③1 896.69±99.26①②③④⑤420.69＜0.001 TNF-α∕（μg∕L）506.99±55.48 1 846.24±99.26①1 840.18±98.98①1 225.33±84.02①②③806.63±69.12①②③2 296.69±99.26①②③④⑤641.52＜0.001中性粒細胞數目∕（×106個∕毫升）5.09±1.98 66.24±2.56①65.18±2.48①45.33±2.22①②③22.63±2.02①②③80.69±2.56①②③④⑤1 561.08＜0.001

2.5 各組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達結果與正常對照組相比，模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，HHI低、高劑量組NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達降低（P＜0.05），且有劑量依賴性；DDC組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達增高（P＜0.05）；HHI+DDC組與模型組相比，NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4，圖2。

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達比較

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達比較

注：HHI為魚腥草注射液，DDC為二硫代氨基甲酸酯，NLRP3為NOD樣受體熱蛋白結構域3，ASC為凋亡相關斑點樣蛋白，caspase-1為胱天蛋白酶-1，IL-6為白細胞介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，β-actin為β肌動蛋白。①與正常對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。③與HHI+DDC組比較，P＜0.05。④與HHI低劑量組比較，P＜0.05。⑤與HHI高劑量組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組HHI+DDC組HHI低劑量組HHI高劑量組DDC組F值P值鼠數10 8 10 10 10 6 NLRP3∕β-actin 0.22±0.12 1.01±0.13①1.02±0.13①0.83±0.11①②③0.52±0.12①②③④1.31±0.13①②③④100.39＜0.001 ASC∕β-actin 0.29±0.11 1.03±0.13①1.04±0.12①0.82±0.12①②③0.54±0.11①②③④1.39±0.13①②③④106.55＜0.001 caspase-1∕β-actin 0.25±0.12 1.06±0.14①1.05±0.14①0.80±0.15①②③0.59±0.12①②③④1.37±0.12①②③④89.75＜0.001 TNF-α∕β-actin 0.31±0.13 1.13±0.17①1.14±0.16①0.86±0.15①②③0.61±0.15①②③④1.43±0.13①②③④74.19＜0.001 IL-6∕β-actin 0.32±0.13 1.16±0.17①1.15±0.16①0.85±0.15①②③0.62±0.14①②③④1.46±0.12①②③④80.38＜0.001

圖2 各組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-6蛋白表達免疫印跡圖

3 討論

肺炎發(fā)病率和死亡率較高，其病原體繁多且以細菌感染最為常見，而LPS是革蘭陰性菌主要致病物質，可引起肺部細菌感染，使肺內中性粒細胞聚集和激活并產生炎癥級聯反應導致肺損傷［10］。霧化吸入LPS所致的動物肺部損傷及病理變化表現穩(wěn)定，接近于臨床急性肺炎發(fā)展情況［11］。本研究采用霧化吸入LPS方法建立小鼠急性肺炎模型，發(fā)現模型組小鼠毛色失去光澤，活動后喘息聲明顯且有死亡，肺組織W∕D、BALF中炎性細胞因子IL-6、TNF-α含量及中性粒細胞數目均明顯高于正常對照組，HE染色可見肺泡破壞、充血、炎性細胞浸潤等病理現象嚴重，與文獻［7］研究模型小鼠吸入LPS 5 h后肺組織病理癥狀結果一致，提示小鼠急性肺炎模型造模成功。

近年來，由于抗生素、糖皮質激素以及免疫抑制劑的濫用、菌種變異和耐藥性的出現，使西醫(yī)抗生素治療肺炎療效變差，肺炎病人病死率逐漸升高［12］。中醫(yī)認為細菌為“風熱之邪”、侵襲人體并首先犯肺，使機體虛邪相合、痰瘀互阻、肺臟宣降功能異常而發(fā)病，且認為肺炎病性屬熱、病位在肺，屬“風溫””肺熱”“咳嗽”等范疇，且用清熱入肺藥物來清熱肅肺、豁痰止咳，達到良好的治療效果［13-14］。魚腥草味辛、性寒涼，歸經為肺，能清熱解毒、消腫療瘡，用治實熱、熱毒、濕邪、疾熱為患的肺癰且為治肺臃要藥，現代藥理研究發(fā)現其具有較好的抗炎效果，有“中藥抗生素”之稱［15］。近來研究發(fā)現，魚腥草可治療肺熱咳嗽、尿路感染等癥，如楊宏志［16］發(fā)現魚腥草為治熱痰妙方-復方鮮竹瀝的主要成分，能清熱解毒，可助鮮竹瀝清熱，生半夏、枇杷葉化痰，證實魚腥草清熱化痰之功，然而其具體分子機制還不明確；岑凱瑩、王海穎［17］發(fā)現魚腥草中藥提取物可降低肺炎支原體感染小鼠血清干擾素及炎性因子IL-6表達水平，證實魚腥草具有較好的抗炎、抗菌效果；陳彤等［18］發(fā)現魚腥草液對大腸埃希菌引起的尿路感染有較好的治療作用，且對膀胱無過敏性損害，證實魚腥草具較好的抑菌效果，但其抑菌作用的具體機制仍不明確?；隰~腥草抗炎、抗菌、清肺熱作用，本研究推測其注射液HHI對急性肺炎有較好的保護作用，并給予LPS誘導的急性肺炎小鼠HHI進行干預治療，發(fā)現HHI低、高劑量組小鼠無死亡，活動后喘息聲減少，肺泡壁破壞、充血、炎性浸潤等病理損傷緩解，W∕D、IL-6、TNF-α含量、中性粒細胞數目均明顯低于模型組，且HHI高劑量組上述肺組織炎性損傷指標改善效果優(yōu)于低劑量組，提示HHI可改善LPS導致的急性肺炎小鼠肺組織炎性損傷，表明HHI對急性肺炎有一定治療作用。但HHI治療急性肺炎的具體分子生物學機制還不明確，本研究建立NLRP3炎癥通路激動劑進行探究，具有一定的臨床意義。

炎癥反應是急性肺炎的病理基礎，NLRP3、ASC、caspase-1共同組成炎癥復合體，ASC可連接NLRP3與caspase-1，并能與NLRP3相互激活，NLRP3活化后可激活效應蛋白caspase-1，影響IL-6、IL-8等炎性因子表達，從而誘發(fā)一系列炎癥反應，加速疾病的發(fā)展［19］。Madouri等［20］發(fā)現體內外激活caspase-1，NLRP3和ASC的表達，可有助于過敏性肺部炎性因子的上調，證實NLRP3∕caspase-1通路參與肺組織炎癥反應過程。本研究發(fā)現模型組小鼠肺組織NLRP3 mRNA及蛋白、ASC mRNA及蛋白、caspase-1、IL-6、TNF-α蛋白表達均高于正常對照組，給予小鼠NLRP3通路激活劑DDC后，小鼠肺組織隨著NLRP3、ASC基因及相關蛋白表達進一步增高后，小鼠喘息聲加重，死亡只數進一步增加，肺泡破壞、充血、炎性細胞浸潤最嚴重，肺組織炎癥損傷相關指標也進一步加重，提示激活NLRP3∕caspase-1通路，可加重肺炎小鼠炎癥反應和肺組織損傷。而隨著HHI劑量升高，小鼠肺組織NLRP3∕caspase-1炎癥通路及相關蛋白表達降低越明顯，且HHI與DDC聯用后，小鼠肺組織NLRP3∕caspase-1炎癥通路及相關蛋白表達與HHI高劑量組相反，肺組炎癥損傷增加，提示DDC可激活NLRP3∕caspase-1通路逆轉HHI緩解肺炎小鼠肺組織炎性損傷，表明HHI可能通過抑制NLRP3∕caspase-1通路激活改善肺炎小鼠炎癥反應，緩解肺損傷。

綜上所述，HHI可通過抑制NLRP3∕caspase-1通路激活，改善肺炎小鼠炎癥反應，緩解肺損傷，為急性肺炎的臨床治療提供理論依據。然而，NLRP3調控機制復雜，且中醫(yī)藥對肺炎的治療具有多靶點的作用，HHI治療急性肺炎的其他分子生物學機制待后續(xù)深入研究。

（本文圖1見插圖1-4）

圖1 各組小鼠肺組織染色圖（HE染色×200）