洛伐他汀調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制研究

弓翠屏，王英

卵巢癌是一種常見女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。研究表明，由于缺少特異性癥狀和臨床早期診斷方法，導(dǎo)致大多數(shù)卵巢癌病人確診時已近晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移［1-2］。對于已轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人，不能采用手術(shù)治療，因此探究新型的化療藥物成為臨床的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是TGF家族的重要成員，在細(xì)胞生長、分化中發(fā)揮重要的作用［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對細(xì)胞轉(zhuǎn)移中上皮細(xì)胞間充質(zhì)化（EMT）過程具有關(guān)鍵調(diào)控作用［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物如辛伐他汀、洛伐他汀不僅具有降血脂的作用，還可抑制腫瘤細(xì)胞的生長［6-7］。據(jù)報(bào)道，辛伐他汀可阻礙TGF-β誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性及EMT過程［8］。因此本研究于2019年8月至2020年5月，以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，探究洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響以及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自美國生物標(biāo)準(zhǔn)品收藏中心公司，胎牛血清、RPMI-1640購自美國Gibco公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，Mataigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，兔抗神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）抗體（1∶300）、鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗體（1∶200）、兔抗上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體（1∶100）、兔抗p38絲裂原活化蛋白 激 酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）抗體（1∶1 000）購自英國Abcam公司，鼠抗Phosphorylation p38 MAPK（p-p38）抗體（1∶2 000）購自美國Santa Cruz公司。電泳轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司，酶標(biāo)儀購自美國Sigma公司。

1.2 SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入10%滅活胎牛血清，5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中，每1～2天換液，細(xì)胞密度達(dá)到80%，胰酶消化傳代。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測SKOV3細(xì)胞增殖洛伐他汀與二甲基亞砜混合，濃度調(diào)整為0、5、10、20、40、60 μmol∕L；TGF-β溶于去離子水，濃度為10 μg∕L；采用不同濃度（0、5、10、20、40、60 μmol∕L）洛伐他汀培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞；以每孔1×104個細(xì)胞接種至96孔板，37℃分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm下SKOV3細(xì)胞吸光值，吸光值越大，表示SKOV3細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SKOV3細(xì)胞遷移率將SKOV3細(xì)胞分為對照組、TGF-β（10 μg∕L）組、洛伐他?。?0 μmol∕L）組、洛伐他汀+TGF-β組；對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，TGF-β（10 μg∕L）組、洛伐他?。?0 μmol∕L）組細(xì)胞中分別加入10 μg∕L TGF-β和10 μmol∕L洛伐他汀處理，洛伐他汀+TGF-β組細(xì)胞中同時加入10 μg∕L TGF-β和10 μmol∕L洛伐他汀處理；收集3×105個SKOV3細(xì)胞，接種至6孔板，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為80%～90%，采用無菌槍頭在培養(yǎng)板中劃線，通過顯微鏡觀察0 h、24 h劃痕面積，計(jì)算遷移率。遷移率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）∕0 h劃痕面積×100%。

1.5 Transwell法檢測SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移將Mataigel膠與無血清培養(yǎng)基置于冰上按1∶8混合，取50 μL Mataigel膠稀釋液覆蓋Transwell上室，37℃孵育2 h，凝固后備用。收集各組培養(yǎng)24 h的SKOV3細(xì)胞，加入200 μL無血清培養(yǎng)基，吸取含1×105個SKOV3細(xì)胞懸浮液加入Transwell上室中，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，棉簽擦掉殘留SKOV3細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡（×200）下檢測侵襲細(xì)胞數(shù)；遷移實(shí)驗(yàn)過程中Transwell上室無須添加Mataigel膠，其與同侵襲。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白水平收集各組SKOV3細(xì)胞，每孔加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白；將蛋白樣品適量稀釋，100℃加熱5 min；吸取40 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST清洗3次，加入一抗（按照說明書進(jìn)行稀釋），4℃過夜，TBST清洗3次，加入二抗，37℃孵育1.5 h，顯影、拍照，Quantity One軟件測定蛋白灰度，分析蛋白灰度值∕GAPDH蛋白灰度值的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)量資料表示為±s，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)，不同濃度、不同時間作用下細(xì)胞增殖活性采用重復(fù)測量方差法分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表1，與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細(xì)胞24 h、48 h和72 h的增殖活性，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與TGF-β（10 μg∕L）組相比，隨著洛伐他汀濃度的不斷增加，5、10、20、40、60 μmol∕L TGF-β誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞24 h、48 h和72 h增殖活性逐漸降低；隨著洛伐他汀作用時間的不斷增加，TGF-β誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞增殖活性逐漸升高；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，10 μmol∕L洛伐他汀在24 h即對TGF-β誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。

表1 不同濃度洛伐他汀對轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

表1 不同濃度洛伐他汀對轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與對照組TGF-β（10 μg∕L）組相比，P＜0.05。③與對照組TGF-β+洛伐他汀5μmol∕L組相比，P＜0.05。④與對照組TGF-β+洛伐他汀10 μmol∕L組相比，P＜0.05。⑤與對照組TGF-β+洛伐他汀20 μmol∕L組相比，P＜0.05。⑥與對照組TGF-β+洛伐他汀40 μmol∕L組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組TGF-β+洛伐他汀35μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀10 μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀20 μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀40 μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀60 μmol∕L組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 3細(xì)胞活性（OD 450 nm）24 h 0.224±0.021 0.885±0.066①0.746±0.059②0.625±0.051②③0.518±0.044②③④0.402±0.033②③④⑤0.276±0.022②③④⑤⑥86.95＜0.001 48 h 0.434±0.041 1.365±0.114①1.173±0.135②1.015±0.062②③0.856±0.067②③④0.703±0.062②③④⑤0.536±0.043②③④⑤⑥51.28＜0.001 72 h 0.688±0.061 1.669±0.123①1.458±0.126②1.284±0.086②③1.101±0.081②③④0.917±0.072②③④⑤0.756±0.071②③④⑤⑥47.72＜0.001

2.2 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞遷移的影響與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細(xì)胞遷移率和遷移細(xì)胞數(shù)，但洛伐他?。?0 μmol∕L）組降低SKOV3細(xì)胞遷移率和遷移細(xì)胞數(shù)；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞遷移率和遷移細(xì)胞數(shù)。見表2。

表2 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞遷移的影響∕

表2 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞遷移的影響∕

注：TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β。①與對照組相比，P＜0.05。②與TGF-β（10 μg∕L）組或洛伐他?。?0 μmol∕L）組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組洛伐他?。?0 μmol∕L）組洛伐他汀+TGF-β組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3遷移率0.423±0.045 0.786±0.074①0.258±0.026①0.485±0.051②54.16＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)163.895±15.473 357.962±32.632①65.241±6.487①212.341±20.523①②100.86＜0.001

2.3 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞侵襲的影響對照組、TGF-β（10 μg∕L）組、洛伐他?。?0 μmol∕L）組、洛伐他汀+TGF-β組的細(xì)胞侵襲數(shù)分別為89.658±8.746、179.635±15.432、32.163±3.054、114.362±10.963，四組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=100.81，P＜0.001）。與對照組相比，TGF-β（10μg∕L）組提高SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)，但洛伐他汀（10 μmol∕L）組降低SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞侵襲數(shù)。

2.4 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞EMT的影響與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin蛋白水平，降低E-cadherin蛋白水平，但洛伐他?。?0 μmol∕L）組降低SKOV3細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin蛋白水平，升高E-cadherin蛋白水平；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin蛋白水平的增加和E-cadherin蛋白水平的降低。見表3，圖1。

表3 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞EMT的影響

表3 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞EMT的影響

注：TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β，N-cadherin為神經(jīng)鈣黏素，E-cadherin為上皮鈣黏素，Vimentin為波形蛋白。①與對照組相比，P＜0.05。②與TGF-β（10 μg∕L）組或洛伐他?。?0 μmol∕L）組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組洛伐他汀（10 μmol∕L）組洛伐他汀+TGF-β組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 N-cadherin 1.000±0.078 2.017±0.186①0.341±0.032①1.325±0.112①②107.47＜0.001 E-cadherin 1.000±0.075 0.569±0.053①2.317±0.216①1.685±0.154①②89.99＜0.001 Vimentin 1.000±0.068 1.698±0.138①0.215±0.023①0.831±0.079①②146.60＜0.001

圖1 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞EMT的影響

2.5 洛 伐 他 汀 對TGF-β誘 導(dǎo)SKOV3細(xì) 胞p38MAPK信號通路的影響各組p38蛋白水平無明顯差異；與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細(xì)胞中p-p38蛋白水平，但洛伐他?。?0 μmol∕L）組降低SKOV3細(xì)胞中p-p38蛋白水平；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞中p-p38蛋白水平的增加。見表4，圖2。

圖2 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞p38MAPK信號通路的影響

表4 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞p38MAPK信號通路的影響

表4 洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞p38MAPK信號通路的影響

注：TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β，p38為p38絲裂原活化蛋白激酶，p-p38為磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶。①與對照組相比，P＜0.05。②與TGF-β（10 μg∕L）組或洛伐他?。?0 μmol∕L）組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組洛伐他?。?0 μmol∕L）組洛伐他汀+TGF-β組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 p38 1.000±0.076 1.023±0.095 1.014±0.103 0.997±0.098 0.05 0.983 p-p38 1.000±0.074 1.897±0.145①0.378±0.039①1.256±0.116①②114.01＜0.001

3 討論

卵巢癌嚴(yán)重威脅女性的生命健康，其發(fā)病機(jī)制是一個多因素參與的過程。臨床上主要采用手術(shù)和放化療結(jié)合，但由于大部分病人確診時已是晚期，無法采取手術(shù)治療，化療易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致病人預(yù)后較差［9-10］。其中腫瘤組織的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及化療耐藥性是目前制約臨床治療效果的主要原因之一。EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移過程中的重要過程，去EMT化已成為腫瘤研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。Ncadherin、Vimentin、E-cadherin是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子［11-12］。E-cadherin是上皮細(xì)胞表型的標(biāo)志物質(zhì)，是EMT過程的關(guān)鍵限速因子；而N-cadherin、Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞表型的標(biāo)志物質(zhì)，E-cadherin表達(dá)量降低及N-cadherin、Vimentin表達(dá)量增加均可促進(jìn)細(xì)胞侵襲、遷移。EMT過程受多種信號因子的調(diào)控，TGF-β是其中最重要的信號因子［13-14］。

洛伐他汀是一種常見他汀類藥物，可抑制羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆u戊酸，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要生物學(xué)功能。臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，洛伐他汀通過抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期，增強(qiáng)細(xì)胞的化療敏感性，為臨床治療鼻咽癌提供新的思路［15］；洛伐他汀通過上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞增殖、凋亡、周期、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)量，從而抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［16］；洛伐他汀通過調(diào)控環(huán)氧合酶-2和過氧化物酶體增殖物活化受體γ誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡［17］。上述研究均表明，洛伐他汀可通過調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)特性抑制腫瘤的病理進(jìn)展，但其在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用及機(jī)制尚不完全清楚。

在本研究中，10 μg∕L TGF-β作用于SKOV3細(xì)胞，提高細(xì)胞增殖活性，增強(qiáng)其侵襲、遷移能力，與前人的研究結(jié)果相似；不同濃度（0、5、10、20、40、60 μmol∕L）洛 伐 他 汀 對10 μg∕L TGF-β作 用 于SKOV3細(xì)胞增殖具有抑制作用，其中10 μmol∕L洛伐他汀在24 h即可明顯抑制細(xì)胞的增殖，因此后續(xù)選取10 μmol∕L洛伐他汀進(jìn)行研究；10 μmol∕L洛伐他汀對10 μg∕L TGF-β作用于SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移具有明顯的抑制作用，提高上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平，降低間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)量，表明洛伐他汀可抑制TGF-β誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及EMT過程。研究證實(shí)，TGF-β、洛伐他汀均可通過調(diào)控p38MAPK信號通路的活性發(fā)揮作用［18-19］。為進(jìn)一步探究洛伐他汀的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測了p38MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白因子p38總蛋白以及磷酸化p38蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀對TGF-β誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞中p38總蛋白水平無明顯影響，但可降低磷酸化p38蛋白水平，表明洛伐他汀可能通過抑制p38MAPK信號通路阻礙TGF-β誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及EMT過程。

綜上所述，洛伐他汀可逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及EMT過程，可能通過抑制p38MAPK信號通路發(fā)揮作用，提示洛伐他汀有可能成為卵巢癌治療的潛在藥物。未來會進(jìn)一步在多株細(xì)胞以及動物模型中進(jìn)一步探究洛伐他汀的抗腫瘤作用，為腫瘤的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。