鋅指E 盒結(jié)合同源盒1 通過(guò)抑制sirtuin3 影響結(jié)腸癌細(xì)胞能量代謝和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制

嚴(yán)冰冰 吳華星 韓嘉晟 袁勝春*

結(jié)腸癌是一種消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球腫瘤中排第三位，已成為腫瘤中的第二大死亡原因。盡管在結(jié)腸癌的診斷和治療方面已取得重大進(jìn)展，但該疾病的5 年生存率仍保持在6%左右[1]。目前，臨床上治療結(jié)腸癌的方法以手術(shù)切除、化療、放療為主，但這些方法不足以完全跟治結(jié)腸癌[2]，因此，在基因?qū)用嫣骄拷Y(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制以進(jìn)一步找尋生物療法至關(guān)重要。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一種形態(tài)學(xué)上的細(xì)胞程序，其定義為從上皮狀態(tài)到間充質(zhì)狀態(tài)的表型轉(zhuǎn)化。上皮狀態(tài)被認(rèn)為是穩(wěn)定的并且能夠定殖，而間充質(zhì)表型被認(rèn)為是亞穩(wěn)態(tài)的。長(zhǎng)期以來(lái)，EMT 一直被認(rèn)為是導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要因素[3]。EMT 由涉及表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄控制的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[4]。鋅指E 盒結(jié)合的同源盒蛋白1（ZEB1）是EMT 的重要調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移方面起著至關(guān)重要的作用[5]。ZEB1 還參與結(jié)腸癌細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)特性的調(diào)節(jié)。此外，據(jù)報(bào)道ZEB1 可以調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的遺傳毒性反應(yīng)和耐藥性，并且是改善化療耐藥性的重要目標(biāo)。ZEB1 是維持結(jié)腸癌細(xì)胞惡性特性的重要因素。

近年來(lái)，異常的癌細(xì)胞代謝在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中的功能受到越來(lái)越多的關(guān)注[6]。實(shí)體瘤細(xì)胞位于微環(huán)境中，其特征是致密的基質(zhì)和有限的血管系統(tǒng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的缺氧狀況。為了在如此惡劣的環(huán)境下生存，癌細(xì)胞必須改變其代謝模式[7]。通過(guò)改變其代謝程序，癌細(xì)胞可以使用有限的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)來(lái)滿足不受控制的增殖和轉(zhuǎn)移需求。與正常細(xì)胞獲取能量的方式不同，癌細(xì)胞依靠糖酵解途徑。從三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生方面來(lái)看，效率并不高，但通過(guò)糖酵解，癌細(xì)胞將葡萄糖分解為小分子，以合成其他大分子[8]。此外，糖酵解產(chǎn)生的乳酸產(chǎn)生了酸性微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)破壞，從而提供了轉(zhuǎn)移優(yōu)勢(shì)[9]。糖酵解是通過(guò)一系列酶促反應(yīng)將葡萄糖降解成丙酮酸并伴有ATP 生成的過(guò)程，一些糖酵解酶如乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT 中起著至關(guān)重要的作用[10-11]。然而，很少報(bào)道EMT 調(diào)節(jié)劑對(duì)糖酵解的影響。

SIRT3 是一種腫瘤抑制因子，定位于線粒體，具有很強(qiáng)的脫乙酰酶活性，可通過(guò)多種途徑抑制糖酵解。SIRT3 會(huì)脫乙?；⒓せ钆c氧化應(yīng)激有關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)中涉及的幾種酶，以及調(diào)節(jié)線粒體代謝的酶，例如異檸檬酸脫氫酶（IDH）或線粒體呼吸鏈復(fù)合物。最近的研究表明，SIRT3 在調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)量和質(zhì)量方面也起著至關(guān)重要的作用，間接影響與線粒體穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因，例如PGC-1α、TFAM 或與線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)[12]。先前研究表明，SIRT3 沉默可增加機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)并導(dǎo)致線粒體功能障礙，使乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性治療敏感[13-14]。本研究就ZEB1 通過(guò)抑制sirtuin3 影響結(jié)腸癌細(xì)胞能量代謝和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620 獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。在含有胎牛血清（FBS）的Dulbecco 改良版Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)SW620 細(xì)胞，最終濃度為10%。

1.2 穩(wěn)定的敲低細(xì)胞系的產(chǎn)生

為了沉默結(jié)腸癌細(xì)胞中ZEB1 的表達(dá)，使用pLKO.1 TRC 克隆載體（Addgene plasmid 10878）[15]針對(duì)ZEB1 目標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染（21 bp，正向：5’-CCTCTCTGAAAAA AGAACACATTA-3’，反向：5’-GCTGTTGTTCTGCCAACAGTT-3’）。通過(guò)慢病毒包裝載體psPAX2 和pMD2.G 以4∶3∶1 的比例共同轉(zhuǎn)染pLKO.1-ZEB1 構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生慢病毒顆粒。通過(guò)用慢病毒感染靶細(xì)胞，然后選擇嘌呤霉素來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法測(cè)量沉默效率。

1.3 RT-PCR

使用TRIzol 試劑（Invitrogen）提取RNA，并使用PrimeScript RT 試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過(guò)RT-PCR 確定指定基因和內(nèi)參基因β-actin 的表達(dá)狀態(tài)。所有反應(yīng)重復(fù)3 次。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 蛋白質(zhì)印跡法

結(jié)腸癌細(xì)胞用冰冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌兩次，并在RIPA 緩沖液中裂解10 min，然后超聲處理以確保完全裂解。在4 ℃下，10 000 g 離心20 min去除細(xì)胞碎片。將全細(xì)胞裂解液（20 μg）在十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液中進(jìn)行變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE，分離膠濃度為10%。將樣品轉(zhuǎn)移到膜上，隨后用特異性抗體進(jìn)行蛋白印跡。ZEB1、SIRT3 和β-actin 抗體購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.5 細(xì)胞外酸化和耗氧率測(cè)量

為了評(píng)估ZEB1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的糖酵解能力和線粒體呼吸的影響，按照Seahorse XF 糖酵解壓力測(cè)試試劑盒和Cell Mito 壓力測(cè)試試劑盒的說(shuō)明，使用Seahorse Bioscience XF96 細(xì)胞外通量分析儀測(cè)量細(xì)胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR），以分析細(xì)胞代謝變化。

1.6 活性氧（ROS）產(chǎn)生分析

為了評(píng)估ZEB1 和SIRT3 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響，使用了Beyotime 活性氧檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。使用可滲透細(xì)胞的熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCF-DA）標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的ROS。DCF-DA 擴(kuò)散到細(xì)胞中后，通過(guò)細(xì)胞酯酶將其脫乙?；癁榉菬晒饣衔?，并被ROS 迅速氧化為DCF。DCF 具有高度熒光性，可以通過(guò)細(xì)胞儀檢測(cè)。熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平正比。

1.7 線粒體膜電位測(cè)量

使用帶有JC-1 染料的線粒體膜電位測(cè)定試劑盒（Beyotime）測(cè)量細(xì)胞膜電位。JC-1 在線粒體中顯示出電位依賴性積累，在正常線粒體的基質(zhì)中可以聚集，在膜電位降低的線粒體中則無(wú)法聚集，JC-1單體發(fā)出綠色熒光（529 nm），JC-1 聚合物發(fā)出紅色熒光（590 nm），通過(guò)紅色/綠色熒光強(qiáng)度比率可以反映線粒體膜電位。

1.8 雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定

為了評(píng)估ZEB1 對(duì)SIRT3 啟動(dòng)子活性的影響，使用了雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega）。從SW620細(xì)胞的基因組DNA 中擴(kuò)增SIRT3 啟動(dòng)子，并連接到pGL3-Basic 載體中以產(chǎn)生pGL3-SIRT3 構(gòu)建體。用海腎熒光素酶載體將pGL3-SIRT3 轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞中。用雙熒光素酶測(cè)定試劑盒評(píng)估ZEB1 對(duì)SIRT3啟動(dòng)子活性的影響。

1.9 芯片分析

為了測(cè)試ZEB1 是否占據(jù)了SIRT3 啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析。使用甲醛處理細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA 交聯(lián)；之后使用超聲波將染色質(zhì)打斷為一定大??；通過(guò)抗體沉淀蛋白-DNA交聯(lián)復(fù)合體；解除交聯(lián)，純化DNA，用PCR 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)DNA 含量。ChIP 分析是使用EZ ChIP 試劑盒（Millipore）和 ZEB1 抗體（Cell Signaling Technologies）進(jìn)行的。用于檢測(cè)與ZEB1 結(jié)合的SIRT3 啟動(dòng)子的引物序列為正向：5'-AGTAGCAGGG ATTACAG GCATGAG-3'，反向：5'-TGCCTTCCCT GAGATACTCAGCT-3'。

1.10 免疫組織化學(xué)分析

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色評(píng)估結(jié)腸癌患者樣品中ZEB1 和SIRT3 的表達(dá)。將石蠟切片在70 ℃下孵育1 h，在二甲苯中脫蠟，然后在梯度乙醇中再水化。用3% H2O2將載玻片孵育30 min。在95 ℃的恒溫箱中用檸檬酸緩沖液（pH6.0）處理抗原?？乖厥蘸螅瑢⑤d玻片與一抗和二抗孵育。以1∶100 的稀釋度使用ZEB1 抗體（Abcam），以1∶50 的稀釋度使用SIRT3 抗體（Abcam）。將切片用3，3-二氨基聯(lián)苯胺染色，在PBS 中終止，并用蘇木精復(fù)染。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用獨(dú)立的學(xué)生t檢驗(yàn)（兩尾）或單向方差分析在SPSS 17.0 版（IBM Corp.）中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Logistic 回歸確定TCGA 隊(duì)列中ZEB1 和SIRT3表達(dá)水平之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZEB1 在結(jié)腸癌中介導(dǎo)有氧糖酵解

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，shZEB1A 和shZEB1B組ZEB1 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 ZEB1 在SW620 細(xì)胞中有效下調(diào)

在ZEB1 沉默的SW620 細(xì)胞中，ECAR 降低，隨著時(shí)間變化，ECAR 呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的趨勢(shì)；在ZEB1 敲低的SW620 細(xì)胞中，OCR 增加，隨著時(shí)間變化，OCR 呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 ZEB1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的ECAR、OCR 影響()

2.2 ZEB1 維持ROS 生成和線粒體膜電位

當(dāng)ZEB1 表達(dá)沉默時(shí)，ROS 產(chǎn)生減少（P＜0.05），線粒體膜電位增加（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 ZEB1 調(diào)節(jié)ROS 產(chǎn)生和線粒體膜電位()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

2.3 ZEB1 與結(jié)腸癌SIRT3 表達(dá)負(fù)相關(guān)

在ZEB1 沉默的SW620 細(xì)胞中，SIRT3 的mRNA水平顯著增加（P＜0.05），SIRT4 和SIRT5 的mRNA水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)表4。在ZEB1 沉默的SW620 細(xì)胞中，SIRT3 的蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 ZEB1 敲低增加了SW620 細(xì)胞中SIRT3 的蛋白表達(dá)水平

表4 ZEB1 敲低增加了SW620 細(xì)胞中SIRT3 的mRNA表達(dá)水平()

表4 ZEB1 敲低增加了SW620 細(xì)胞中SIRT3 的mRNA表達(dá)水平()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

為了進(jìn)一步探討ZEB1 和SIRT3 之間的相關(guān)性，分析了結(jié)腸癌患者中ZEB1 和SIRT3 的表達(dá)。IHC染色檢查ZEB1 和SIRT3 之間的表達(dá)相關(guān)，結(jié)果顯示：較高ZEB1 表達(dá)的結(jié)腸癌患者顯示較低SIRT3表達(dá)（圖3）。

圖3 較高ZEB1 表達(dá)的結(jié)腸癌患者顯示較低SIRT3 表達(dá)

2.4 SIRT3 是ZEB1 的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)

雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定ZEB1 對(duì)SIRT3 啟動(dòng)子熒光素酶活性的影響，結(jié)果表明ZEB1 以劑量依賴性方式抑制SIRT3 啟動(dòng)子活性，結(jié)果如表5 所示。

表5 ZEB1 以劑量依賴性方式抑制SIRT3 啟動(dòng)子熒光素酶活性

2.5 表觀遺傳因子MBD1 可與結(jié)腸癌細(xì)胞中ZEB1相互作用

ChIP 分析表明，ZEB1 與MBD1 相互作用（圖4A），且在SW620 細(xì)胞的細(xì)胞核中共定位（圖4B）。

圖4 表觀遺傳因子MBD1 可與結(jié)腸癌細(xì)胞中ZEB1 相互作用

2.6 MBD1 積極調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞中有氧糖酵解和ROS 的產(chǎn)生

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證MBD1 沉默的SW620 細(xì)胞系的擊倒效率（圖5A）。接下來(lái)，使用海馬能量通量分析儀測(cè)試了MBD1 對(duì)糖酵解的影響。MBD1沉默抑制了SW620 細(xì)胞中的ECAR 值，MBD1 沉默細(xì)胞系中OCR 值增加，MBD1 沉默可降低結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生（圖5B）。

圖5 MBD1 積極調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞中有氧糖酵解和ROS 的產(chǎn)生

2.7 ZEB1 與MBD1 相互作用以抑制SIRT3 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

如上所述，ZEB1 負(fù)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞中SIRT3 的表達(dá)。接下來(lái)探究MBD1 是否在ZEB1 介導(dǎo)的SIRT3抑制中起輔助因子的作用。雙重?zé)晒馑孛笝z測(cè)結(jié)果表明MBD1 抑制了SIRT3 啟動(dòng)子活性，而ZEB1 與MBD1 的共轉(zhuǎn)染則更加顯著地抑制了SIRT3 啟動(dòng)子活性。見(jiàn)表6。

表6 ZEB1 和MBD1 相互作用抑制SIRT3 啟動(dòng)子熒光素酶活性()

表6 ZEB1 和MBD1 相互作用抑制SIRT3 啟動(dòng)子熒光素酶活性()

注：*P＜0.05，**P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

ChIP 分析證明ZEB1 和MBD1 在SIRT3 啟動(dòng)子區(qū)域富集（圖6A）。reChIP 分析證明ZEB1 和MBD1同時(shí)占據(jù)SIRT3 啟動(dòng)子的同一區(qū)域（圖6B）?？偠灾?，ZEB1 和MBD1 相互作用抑制SIRT3 表達(dá)，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌中有氧糖酵解。

圖6 ZEB1與MBD1相互作用以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中sirtuin 3 的表達(dá)

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，EMT 在腫瘤進(jìn)展中起重要作用[16]。EMT 在結(jié)腸癌發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，ZEB1 是糖酵解的負(fù)調(diào)節(jié)劑，在從線粒體到糖酵解的新陳代謝重編程過(guò)程中，線粒體呼吸受到損害，可以通過(guò)OCR 進(jìn)行測(cè)試其在誘導(dǎo)和維持EMT 中起著重要作用，本研究結(jié)果表明，在ZEB1 沉默的SW620 細(xì)胞中，ECAR 降低，在ZEB1敲低的SW620 細(xì)胞中，OCR 增加，說(shuō)明ZEB1 是線粒體呼吸的負(fù)調(diào)節(jié)劑，也說(shuō)明ZEB1 是結(jié)腸癌中有氧糖酵解的正調(diào)節(jié)劑。ROS 的產(chǎn)生是糖酵解的凈結(jié)果，而糖酵解又對(duì)有氧糖酵解產(chǎn)生積極影響，ZEB1 表達(dá)沉默時(shí)，ROS 產(chǎn)生減少，說(shuō)明ZEB1 在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)ROS 產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用。癌細(xì)胞通過(guò)有氧糖酵解利用葡萄糖，在此過(guò)程中，線粒體膜電位降低。ZEB1 沉默后，線粒體膜電位增加，表明ZEB1 可以維持ROS 的產(chǎn)生并調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞中的線粒體膜電位。Sirtuin 家族成員（包括SIRT1-7）是脫乙?；?，可調(diào)節(jié)細(xì)胞中的新陳代謝、衰老、能量和氧化還原穩(wěn)態(tài)。其中SIRT3、SIRT4 和SIRT5 定位于線粒體并負(fù)向調(diào)節(jié)糖酵解。因此，本研究檢測(cè)了ZEB1 對(duì)SW620 細(xì)胞中SIRT3、SIRT4 和SIRT5 表達(dá)的影響。ZEB1 在其下游轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合E-box（CANNTG）或Z-box（CAGGTA）序列。本研究分析了SIRT3 的啟動(dòng)子區(qū)域（從-2500 到+200），并確定了啟動(dòng)子區(qū)域中潛在的Z 框。雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定ZEB1 對(duì)SIRT3 啟動(dòng)子熒光素酶活性的影響，結(jié)果表明ZEB1 以劑量依賴性方式抑制SIRT3 啟動(dòng)子活性。先前研究表明，表觀遺傳因子甲基-CpG 結(jié)合域蛋白1（MBD1）與TWIST 在結(jié)腸癌細(xì)胞中相互作用以誘導(dǎo)EMT。ZEB1 和TWIST 在促進(jìn)轉(zhuǎn)移方面有共同的下游目標(biāo)。因此，本研究驗(yàn)證ZEB1 是否可以與結(jié)腸癌患者的MBD1 相互作用。MBD1 沉默抑制了SW620 細(xì)胞中的ECAR 值，表明MBD1 充當(dāng)糖酵解的正調(diào)節(jié)劑。MBD1 沉默細(xì)胞系中OCR 值增加，表明MBD1 充當(dāng)線粒體呼吸調(diào)節(jié)因子的負(fù)調(diào)節(jié)劑。MBD1 沉默可降低結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生。這些結(jié)果證實(shí)MBD1 積極調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞中的耗氧糖酵解和ROS 的產(chǎn)生。

在分化程度低的結(jié)腸癌樣品和分化的結(jié)腸癌腫瘤衍生的浸潤(rùn)細(xì)胞中ZEB1 表達(dá)增加，因此其可作為結(jié)腸癌細(xì)胞存活的預(yù)后標(biāo)志物。然而，很少討論ZEB1 對(duì)癌細(xì)胞代謝的影響。在乳腺癌中，EMT 調(diào)節(jié)劑SNAIL 通過(guò)抑制果糖雙磷酸酶1（FBP1）在誘導(dǎo)有氧糖酵解中起積極作用。FBP1 是糖酵解的負(fù)調(diào)節(jié)劑，可催化糖異生。在乳腺癌、透明腎細(xì)胞癌和胃癌中，F(xiàn)BP1 發(fā)揮抑癌作用。因此，SNAIL 介導(dǎo)的FBP1 抑制為侵襲性癌細(xì)胞帶來(lái)了代謝優(yōu)勢(shì)[17]。研究表明，ZEB1 可抑制SIRT3 表達(dá)。SIRT3 是線粒體抑癌基因，對(duì)糖酵解有負(fù)調(diào)控作用[18]。除了其在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中的作用外，SIRT3 可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中的EMT 及EMT 轉(zhuǎn)移。例如，作為脫乙?；?，SIRT3可以使S 相激酶相關(guān)蛋白2（SKP2）脫乙?；Ｃ撘阴；?SKP2 的連接酶活性降低，從而逆轉(zhuǎn)了EMT[19]。因此，SIRT3 充當(dāng)EMT 的負(fù)調(diào)節(jié)器。

SIRT3 是一種腫瘤抑制因子，對(duì)糖酵解和EMT負(fù)調(diào)控。但是，很少討論SIRT3 失調(diào)在癌癥中的調(diào)控機(jī)制。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ2α，一種調(diào)節(jié)線粒體發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子，也通過(guò)雌激素相關(guān)受體-α（ERR-α）調(diào)節(jié)SIRT3 表達(dá)，并且在啟動(dòng)子中存在一個(gè)推定的ERR-α 投標(biāo)元件SIRT3 的區(qū)域。另一個(gè)觀察結(jié)果是，SIRT3 隨ROS 產(chǎn)量增加而特異性上調(diào)。這種上調(diào)可以通過(guò)涉及轉(zhuǎn)錄因子（如Nrf2）的氧氣傳感機(jī)制來(lái)控制。在此過(guò)程中，還觀察到了ROS 水平的變化，因此可以認(rèn)為EMT 調(diào)節(jié)劑可以對(duì)SIRT3 表達(dá)產(chǎn)生某些影響。據(jù)報(bào)道，MBD1 是一種可以與甲基化的CpG 島特異性結(jié)合的表觀遺傳因子，在結(jié)腸癌中被上調(diào)，并調(diào)節(jié)EMT 以及化學(xué)療法和放射療法的抵抗力[20]。在本研究中，ZEB1 與MBD1相互作用，并且這兩個(gè)蛋白共同占據(jù)SIRT3 啟動(dòng)子區(qū)域，表明ZEB1/MBD1 復(fù)合物調(diào)節(jié)SIRT3 表達(dá)。

綜上所述，SW620 癌細(xì)胞中的ZEB1 通過(guò)與MBD1 相互作用沉默SIRT3 表達(dá)，從而導(dǎo)致線粒體能量代謝功能障礙，最終影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，可能是細(xì)胞對(duì)治療更加敏感的治療策略。本研究闡明了通過(guò)減少燃料供應(yīng)和抑制糖酵解來(lái)抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的可能性，發(fā)現(xiàn)了EMT 和糖酵解之間的新型聯(lián)系，為結(jié)腸癌提供了潛在的治療靶標(biāo)。