高效液相色譜法測(cè)定巧克力食品中7 種合成著色劑的研究

張海神，周瑞錚，莫淑梅

（東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東東莞 523000）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品的要求日趨嚴(yán)格，在充分注重安全性的前提下，也格外注重口感和外觀。合成色素因具有賦予食品色澤和改善食品色澤的特質(zhì)，在現(xiàn)代食品加工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[1]，但合成色素大多數(shù)對(duì)人體有害[2]，具有潛在的致泄性、臟器功能損害與致癌性。因此，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中合成色素的最大使用量和檢出限做出了明確規(guī)定。目前，通用的合成色素檢測(cè)方法[3]主要有高效液相色譜法[4-6]、固相萃取-超高效液相色譜法[7-8]、全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、紫外分光光度法[10]、電分析化學(xué)法[11]。在休閑食品中，巧克力食品因其獨(dú)特的口味廣受消費(fèi)者喜愛(ài)，市面上巧克力制品種類繁多，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)雖然明確規(guī)定了巧克力制品的檢測(cè)方法，但在日常工作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用高效液相色譜法，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35—2016 檢測(cè)，檸檬黃和新紅兩色譜峰出峰時(shí)間過(guò)于緊密、分離度差、難以定量，不利于食品安全檢測(cè)工作進(jìn)行。基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化色譜條件同時(shí)測(cè)定巧克力食品中7 種合成色素，以期為實(shí)驗(yàn)室測(cè)定合成色素提供參考意見(jiàn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1 儀器

U-3000 型高效液相色譜儀，戴安公司產(chǎn)品；帶二級(jí)管陣列檢測(cè)器DAD；HWS-24 型電熱恒溫水浴鍋，泰斯特公司產(chǎn)品；純水儀，密理博公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），F(xiàn)isher 公司提供；0.02 mol/L 乙酸銨溶液；聚酰胺粉；純水（為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水）。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 樣品預(yù)處理

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測(cè)定》[12]進(jìn)行樣品前處理。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將上述7 種標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用移液管稀釋成0.5，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 質(zhì)量濃度工作梯度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化對(duì)比

優(yōu)化國(guó)標(biāo)色譜條件，在波長(zhǎng)為254 nm 條件下，高效液相色譜儀分析，二極管陣列器檢測(cè)，甲醇+乙腈（1∶1）和0.02 mol/L 乙酸銨溶液梯度洗脫，外標(biāo)法定量。

國(guó)標(biāo)方法與改進(jìn)方法對(duì)比見(jiàn)表1。

表1 國(guó)標(biāo)方法與改進(jìn)方法對(duì)比

2.2 儀器條件

色譜柱型號(hào)：C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL；二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相D 為乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1）；流速為1.0 mL/min。

梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

2.3 色譜圖

7 種合成色素色譜條件優(yōu)化后圖譜（波長(zhǎng)254 nm）見(jiàn)圖2。

圖2 7 種合成色素色譜條件優(yōu)化后圖譜（波長(zhǎng)254 nm）

優(yōu)化前檸檬黃和新紅兩色譜峰的保留時(shí)間差為0.21 min，優(yōu)化后的保留時(shí)間差為0.28 min。表明此優(yōu)化方式能夠有效分離檸檬黃和新紅，減少兩峰黏連，同時(shí)其他5 種色素分離效果較好。

2.4 線性方程和檢出限

2.4.1 線性方程

以響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)做工作曲線。

7 種合成色素的保留時(shí)間、線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 7 種合成色素的保留時(shí)間、線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)

由表3 可知，質(zhì)量濃度為0.5～20.0 μg/mL 時(shí)，7 種合成色素相關(guān)系數(shù)為0.999 8～0.999 9，線性關(guān)系好。

2.4.2 方法檢出限

取曲線低點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試10 次，取其信噪比，3 倍信噪比計(jì)算檢出限，10 倍信噪比計(jì)算定量限見(jiàn)表4。

7 種合成色素的優(yōu)化方法定量限、檢出限和國(guó)標(biāo)檢出限見(jiàn)表4。

表4 7 種合成色素的優(yōu)化方法定量限、檢出限和國(guó)標(biāo)檢出限

由表4 可知，在吸收波長(zhǎng)為254 nm 時(shí)，所測(cè)得檢出限均低于標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出限，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

按照檢出限低點(diǎn)，曲線的中點(diǎn)和高點(diǎn)或指標(biāo)限量值進(jìn)行加標(biāo)，同樣品一起前處理、測(cè)試，分3 個(gè)水平加標(biāo)（即低點(diǎn)加標(biāo)、中點(diǎn)加標(biāo)、高點(diǎn)加標(biāo)），每個(gè)水平重復(fù)測(cè)量6 次。

加標(biāo)回收率和精密度見(jiàn)表5。

表5 加標(biāo)回收率和精密度

由表5 可知，7 種不同色素的回收率為86.9%～98.3%，變異系數(shù)為0.5%～2.1%，均符合國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)語(yǔ)

按照GB 5009.35—2016 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜法檢測(cè)食品中合成色素，在實(shí)際工作中易出現(xiàn)檸檬黃和新紅兩色譜峰黏連現(xiàn)象，不易于工作進(jìn)行。經(jīng)過(guò)色譜條件的優(yōu)化，巧克力產(chǎn)品中的7 種合成色素可以有效分離。色譜條件的優(yōu)化可通過(guò)改變流動(dòng)相溶劑組成和配比實(shí)現(xiàn)，參考朱彭玲梯度洗脫[13]，此改進(jìn)方法通過(guò)增加溶劑乙腈增加流動(dòng)相A 溶劑的極性，擴(kuò)大流動(dòng)相間的極性差，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子，改善峰型，提高分離能力，實(shí)現(xiàn)各組分最佳分離。改進(jìn)方法中采用甲醇+乙腈（1∶1）比例混合，在實(shí)現(xiàn)各組分充分分離條件下，既可以最大限度節(jié)約成本和降低色譜柱壓力，又在一定程度上有效降低檢測(cè)成本和儀器維護(hù)成本。優(yōu)化方法檢測(cè)巧克力食品中7 種合成色素分離效果良好，檢出限、加標(biāo)回收率和精密度均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，在同類研究中，李媛媛等人[14]曾在高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中多種合成色素的方法探究一文中以0.02 mol/L 乙酸銨溶液和甲醇+乙腈（3∶1）為流動(dòng)相使各組分有效分離，方法加標(biāo)回收率為92.0%～99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～1.4%，均優(yōu)于改進(jìn)方法的試驗(yàn)結(jié)果，但該改進(jìn)方法使用的甲醇少，具有降低色譜柱壓力、延長(zhǎng)色譜柱使用壽命的優(yōu)點(diǎn)，另結(jié)果存在差異的原因主要在于試驗(yàn)樣品基質(zhì)本底不同和試驗(yàn)前處理方法不同，故此改進(jìn)方法可從這2 個(gè)方面繼續(xù)優(yōu)化改進(jìn)。

采用優(yōu)化后的色譜條件測(cè)定巧克力食品中7 種合成色素，能夠有效分離7 種色譜峰，有利于企業(yè)開(kāi)展檢測(cè)工作，提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率，從而能給相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提供參考作用。