高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定雞蛋中的甲硝唑

張金磊，邢麗杰，羅瑞峰，張 飛，陳永發(fā)，鞏婧婷，賀玉鳳

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測(cè)試中心，新疆石河子 832000）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，雞蛋作為日常膳食中蛋白質(zhì)主要來(lái)源，越來(lái)越有著不可替代的作用[1]。甲硝唑是人工合成硝基咪唑類藥物，對(duì)家禽的滴蟲(chóng)病感染、腸道的厭氧菌感染、生殖系統(tǒng)疾病等有著很好的療效[2-3]。因而常作為驅(qū)蟲(chóng)藥添加在飼料中，并且可用于改善飼料轉(zhuǎn)化率。如果養(yǎng)殖過(guò)程中用藥不規(guī)范，沒(méi)有遵守休藥期，甲硝唑加入飼料中，容易造成動(dòng)物源性食品中甲硝唑的殘留[4]。然而甲硝唑?qū)θ梭w有多種毒副作用，尤其具有潛在致癌性和致遺傳變異作用[5-6]，且甲硝唑進(jìn)入人體后能快速分布于全身，因此對(duì)雞蛋中甲硝唑的殘留檢驗(yàn)非常必要。

歐盟在1998 年規(guī)定甲硝唑在食品動(dòng)物體中不得檢出，在2019 年，我國(guó)發(fā)布的GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，甲硝唑藥物允許作為治療動(dòng)物疾病使用，并且在動(dòng)物源性食品中不得檢出[7]。目前，甲硝唑殘留檢測(cè)的方法主要包括液相色譜法[8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]等。但是針對(duì)動(dòng)物肌肉組織中的甲硝唑殘留檢測(cè)方法研究較多，雞蛋液體基質(zhì)比肌肉固體組織復(fù)雜?，F(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法對(duì)雞蛋中甲硝唑殘留檢測(cè)分析較少[12]；同時(shí)，前處理方法復(fù)雜繁瑣，不利于大批量檢測(cè)。因此，通過(guò)對(duì)雞蛋中甲硝唑的提取、凈化及流動(dòng)相組成等因素的優(yōu)化，建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)雞蛋中甲硝唑的方法，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、快速、高效，適用于雞蛋中甲硝唑殘留的篩查和測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

甲醇、乙腈、甲酸（HPLC 級(jí)），德國(guó)CNW 公司提供；甲硝唑（純度大于99.0%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司提供；超純水；雞蛋，購(gòu)自當(dāng)?shù)夭煌?、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和生產(chǎn)基地，去殼，經(jīng)勻漿（10 000 r/min）后，置于-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1200+6460 型高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；MS3 basic 型漩渦混合器，德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；Sigma 3-30k 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；KQ-600DE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；IQ7000 型超純水儀，美國(guó)Milli-Q 公司產(chǎn)品。

1.3 UPLC-MS/MS 檢測(cè)條件

色譜條件：ZORBAX SB-Aq Solvent Saver Plus（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱，色譜柱溫度30 ℃，流動(dòng)相組成：水-甲醇（梯度），進(jìn)樣量5 μL，流速0.6 mL/min，梯度洗脫。

以水-甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 以水-甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。

甲硝唑的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 甲硝唑的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

稱取經(jīng)勻漿后的雞蛋2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入0.2%甲酸乙腈溶液10 mL，渦旋振蕩混勻1 min，30 ℃下恒溫超聲提取30 min；以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min，取上清液5 mL 直接加入到PRiME HLB 固相萃取小柱上，無(wú)需活化，控制流速在3～4 mL/min，收集全部流出液。于40 ℃下氮吹至近干，用0.1%甲酸水+甲醇（90+10）溶液定容至2 mL，渦旋混勻后過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，供HPLC-MS/MS 法測(cè)定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用甲醇溶于25 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20 ℃下避光保存。準(zhǔn)確移取0.025 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配置成1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用基質(zhì)空白溶液將中間液逐級(jí)稀釋，配制成2，4，10，20，30，40 ng/mL的甲硝唑系列工作溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，供高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)100 ng/mL甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液多次注射進(jìn)樣，通過(guò)對(duì)鞘氣溫度、鞘氣流速，毛細(xì)管電壓、碰撞電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇穩(wěn)定性好、豐度高和干擾小的2 個(gè)碎片離子作為甲硝唑定量離子和定性離子，并以豐度最強(qiáng)、響應(yīng)值最高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。

甲硝唑的MRM 離子對(duì)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 甲硝唑的MRM 離子對(duì)質(zhì)譜圖

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

通過(guò)比較水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇4 種流動(dòng)相體系對(duì)甲硝唑響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相為水-甲醇體系，甲硝唑的響應(yīng)較高。因此，選用水-甲醇體系作為檢測(cè)雞蛋中甲硝唑的流動(dòng)相。

不同流動(dòng)相體系對(duì)甲硝唑提取效率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同流動(dòng)相體系對(duì)甲硝唑提取效率的影響

2.2 提取條件的選擇與優(yōu)化

甲硝唑?qū)儆谙趸溥蝾愃幬?，微溶于乙醇和水，在乙酸乙酯和乙腈中有較好的溶解性。雞蛋中有蛋白質(zhì)、脂肪、水、磷脂等物質(zhì)，由于乙酸乙酯和乙腈都可以較好地提取雞蛋中的甲硝唑，但是乙酸乙酯提取的雜質(zhì)較多，且對(duì)儀器干擾較大。而乙腈作為提取溶劑，可以起到沉淀蛋白質(zhì)的作用，可通過(guò)離心去除。但是大量的脂肪和磷脂類會(huì)和目標(biāo)物一起提取出來(lái)，這些物質(zhì)會(huì)干擾LC-MS 分析，污染液相系統(tǒng)。所以，試驗(yàn)選擇用PRiME HLB 小柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，PRiME HLB 小柱可有效去除提取液中大部分脂肪和磷脂類物質(zhì)，從而達(dá)到凈化除雜的目的。

3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

3.1 線性關(guān)系和檢出限

取6 份空白樣品，樣品經(jīng)過(guò)前處理得到空白基質(zhì)，取一定量的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，配制成?biāo)準(zhǔn)系列工作曲線。在優(yōu)化后的前處理和儀器條件下，對(duì)一系列空白基質(zhì)中添加的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，甲硝唑在2～40 ng/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。信噪比S/N 為3 時(shí)，計(jì)算甲硝唑的檢出限為0.5 μg/kg，信噪比S/N為10 時(shí)，計(jì)算甲硝唑的定量限為1 μg/kg。該方法線性關(guān)系良好、靈敏度高。

甲硝唑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 甲硝唑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

3.2 回收率和精密度

選取空白雞蛋樣品，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行3 個(gè)質(zhì)量濃度水平添加回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6 次。

甲硝唑的回收率和精密度見(jiàn)表4。

表4 甲硝唑的回收率和精密度

雞蛋中甲硝唑的平均回收率為83.2%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～1.2%。說(shuō)明該方法回收率和精密度良好。

雞蛋空白樣品添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)見(jiàn)圖3，雞蛋空白樣品LC-MS/MS 譜圖見(jiàn)圖4，雞蛋樣品中添加量為4 μg/kg 的LC-MS/MS 譜圖見(jiàn)圖5。

圖3 雞蛋空白樣品添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)

圖4 雞蛋空白樣品LC-MS/MS 譜圖

圖5 雞蛋樣品中添加量為4 μg/kg 的LC-MS/MS 譜圖

4 與標(biāo)準(zhǔn)比較

在SN/T 2624—2010《動(dòng)物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法中樣品提取凈化方法繁瑣、復(fù)雜，且步驟繁多。需要用到的試劑很多，并且提取試劑用量較大，凈化過(guò)程繁雜，需要多次轉(zhuǎn)移提取液，試驗(yàn)的可操作性差、重現(xiàn)性較低、試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用于大批量檢測(cè)。試驗(yàn)試劑用量較少，固相萃取柱無(wú)需活化，大大提高了前處理速度，提高了檢測(cè)效率，適用于大批量的篩查和測(cè)定。

5 結(jié)論

采用ZORBAX SB-Aq 型色譜柱分離，優(yōu)化了液相、質(zhì)譜、提取及凈化等條件，提高了雞蛋中甲硝唑的提取和凈化效率，方法學(xué)驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果良好。表明該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，且高效、快速操作簡(jiǎn)單，適于雞蛋中甲硝唑的快速篩查和測(cè)定。