HPLC－MS/MS法測定嬰幼兒果蔬米粉中17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物

郭禮強，劉永強，王 樂，李 凱，徐曉杰

（1．濰坊海關，山東 濰坊 261041；2．濟南海關技術中心，山東 濟南 250014）

新煙堿類殺蟲劑目前占據全球殺蟲劑市場的25%［1］，使用后約有20%會被植物吸收利用［2－4］，能夠以原藥或代謝產物形態(tài)在植物果實內積累［5－6］。Craddock等［7］報道美國農業(yè)部1999～2015年間監(jiān)控的食品和水中新煙堿類殺蟲劑的檢出率高達4.5%，其中5%的果蔬樣本中同時檢出2種新煙堿類殺蟲劑。Chen等［8］調查發(fā)現所有水果及蔬菜樣本（油桃及番茄除外）及90%的蜂蜜樣本中至少檢出1種新煙堿類殺蟲劑，72%的水果、45%的蔬菜和50%的蜂蜜樣品中至少含有2種新煙堿類殺蟲劑，甚至在植物樣本中檢測到其代謝物（如烯式吡蟲啉或羥基吡蟲啉）［9］。嬰幼兒食用殘留有新煙堿類殺蟲劑的米粉會對身體產生不利影響，Keil等［10］報道吡蟲啉可使嬰兒患自閉癥的幾率增加2倍，Carmichael等［11］報道孕婦在懷孕早期暴露于新煙堿類殺蟲劑與新生兒特定心臟缺陷表型有一定關聯，余晉霞等［12］研究發(fā)現新煙堿類殺蟲劑影響兒童體內的性激素水平。嬰幼兒果蔬米粉主要原料為大米或小米、水果和蔬菜等，易殘留新煙堿類殺蟲劑，而關于嬰幼兒米粉中新煙堿類殺蟲劑的檢測方法較少，涵蓋種類不足，因此非常有必要開發(fā)一種簡便、快速、全面的嬰幼兒米粉中新煙堿類殺蟲劑殘留的檢測方法，以保護嬰幼兒身體健康。

當前新煙堿類殺蟲劑的檢測方法主要為液相色譜法［13－15］和高效液相色譜－串聯質譜法（HPLCMS/MS）［16－18］，但研究種類少，研究基質多為谷物、蔬菜、土壤、水果和蜂蜜等初級原料，而關于基質更復雜危害更大的嬰幼兒食品則鮮有報道。相較于液相色譜法，HPLC－MS/MS法的靈敏度好，檢測通量高，定性定量準確，本文基于QuEChERS凈化技術，選取嬰幼兒代表性輔食米粉為研究基質，建立了同時測定嬰幼兒果蔬米粉中17種新煙堿類殺蟲劑及其代謝物殘留的HPLC－MS/MS法，可為嬰幼兒輔食中新煙堿類殺蟲劑的綜合性評估提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LCMS8045液相色譜－串聯質譜儀（日本島津公司）；N-EVAP111氮吹儀（美國Organomation公司）；MS3渦混振蕩器（德國艾卡公司）；KQ－500E數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

標準品：吡蟲啉、環(huán)氧蟲啶、噻蟲嗪、噻蟲胺和氟啶蟲酰胺購于Dr.Ehrenstorfer公司；烯啶蟲胺和氟啶蟲胺腈購于CATO公司；啶蟲脒、去甲基啶蟲脒、噻蟲啉、氯噻啉、去甲基噻蟲胺和呋蟲胺購于壇墨公司；5-羥基吡蟲啉、呋蟲胺代謝物DN、呋蟲胺代謝物UF和氟啶蟲酰胺代謝物TFNG購于阿爾塔公司。石墨炭黑粉（GCB）、C18粉、N-丙基乙二胺（PSA粉）、氨丙基粉（NH2）和Captiva EMR－Lipid（EMR）粉購于美國安捷倫公司；分子篩（MS）購于南京先豐納米科技公司；超純多壁碳納米管（CNT）購于蘇州碳豐科技公司；甲醇、甲酸、乙腈和乙酸乙酯均為色譜純（美國Thermo Fisher公司）；實驗用水為自制超純水。

標準品儲備液：17種標準物質分別用乙腈配制質量濃度為100 mg/L的標準品儲備液，于-18℃冰箱保存?；旌蠘藴手虚g液：分別取100 μL各標準品儲備液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制質量濃度為1 mg/L的混合標準中間液。

定容液：1 mL甲酸、800 mL去離子水和200 mL乙腈混勻即得。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.1%（體積分數）甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～0.1 min，20%B；0.1～3.5 min，20%～45%B；3.5～5.0 min，45%～75%B；5.0～7.5 min，75%～20%B；7.5～10 min，20%B。柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：10 μL。

1.2.2 質譜條件多反應監(jiān)測（MRM）模式：電噴霧電離源正離子掃描（ESI+）；碰撞氣：氬氣；加熱氣：空氣，流速為9.5 L/min；干燥氣：氮氣，流速為9.5 L/min；霧化氣：氮氣，流速為3.5 L/min；DL溫度：255℃；接口溫度：350℃。

1.2.3 提取方法準確稱量5.0 g米粉樣品，轉移至50 mL離心管中，加入5 mL水潤濕樣品，靜置10 min。依次加入1 g無水MgSO4和20 mL含1%（體積分數）甲酸的乙腈后渦旋30 s，超聲20 min，以5 000 r/min離心10 min。轉移10 mL上清液至玻璃管中氮氣吹干，加入50 mg PSA、20 mg C18和1 mL定容液，渦旋1 min，取溶液經0.22 μm濾膜過濾，待測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

用定容液將17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物的標準儲備液稀釋為1 mg/L，以自動進樣器分別進樣，通過質譜掃描發(fā)現，17種目標物在正離子模式下的響應值均比負離子模式下高5倍以上。因此，在正離子模式下全掃描確定各目標物的母離子，進一步通過子離子掃描確定響應值最高的2個子離子。通過軟件自動優(yōu)化模式進一步精確優(yōu)化各化合物的母離子、子離子和碰撞能量，選擇響應值最高的子離子作為定量離子，響應值次高的子離子為定性離子，17種目標物的部分質譜參數見表1。

表1 17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物的質譜參數Table 1 MS parameters of 17 neonicotinoid pesticides and their metabolites

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實驗以0.1%甲酸水溶液－甲醇為流動相時，烯啶蟲胺、呋蟲胺和環(huán)氧蟲啶的色譜圖出現扁平峰，響應值低，峰形不理想；將有機相改為乙腈時，峰形得到改善，進一步提高甲酸比例為0.2%時，多數新煙堿類殺蟲劑的響應值提高，而DN、UF和TFNG等代謝物的響應值變差。綜合考慮，確定以0.1%甲酸水溶液－乙腈為流動相，17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物的色譜峰形比較理想，定量離子色譜圖見圖1。

圖1 17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物的色譜圖（0.5 μg/L）Fig.1 Chromatograms of 17 neonicotinoid pesticides and their metabolites（0.5 μg/L）the peak numbers of 1－17 denoted were the same as those in Table 1

2.3 提取方法的優(yōu)化

以胡蘿卜米粉為基質（加標濃度10 μg/kg），比較了甲醇［19］、乙腈［20－21］和乙酸乙酯對17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物的提取回收率。結果顯示，以甲醇為提取溶劑時，提取液殘留有較多雜質，導致質譜背景噪音大；以乙酸乙酯為提取溶劑時回收率最低，并攜帶較多色素；以乙腈為提取溶劑時回收率最高，17種目標物的回收率為27.4%～50.8%。由于在酸性條件下，5-羥基吡蟲啉和去甲基啶蟲脒等代謝物更穩(wěn)定不易分解，所有目標物的回收率均可提高5.1%以上，最終確定提取溶劑為含1%甲酸的乙腈。新煙堿類殺蟲劑的內吸性好［22］，主要殘留在果實內部，實驗發(fā)現，先加水潤濕樣品可以促進乙腈對樣品中目標物的提取，但部分雜質會進入乙腈提取液，而通過加入無水硫酸鎂可使乙腈和水分層減少雜質的引入。實驗進一步對比了振蕩和超聲2種提取方法對目標物回收率的影響，結果顯示振蕩提取的回收率低于超聲提取，且超聲提取20 min可達到提取效果。實驗最終確定以含1%甲酸的乙腈為溶劑，加無水硫酸鎂后超聲提取，具體見“1.2.3”，17種目標物的回收率為39.0%～71.6%。

2.4 凈化方式的選擇

果蔬米粉基質復雜，本文采用QuEChERS凈化方法［21－22］，考察了GCB、C18、PSA、NH2、EMR粉、CNT和MS 7種凈化劑對17種目標物的回收率，10 μg/kg的混合標準溶液中分別添加50 mg凈化劑后經質譜檢測，回收率結果見圖2。實驗發(fā)現GCB、CNT和MS對多數新煙堿類殺蟲劑的吸附非常嚴重，EMR粉對吡蟲啉、噻蟲啉和氟啶蟲胺腈等也有較嚴重的吸附，C18、PSA和NH2對17種目標物的吸附影響較小。C18可以有效去除米粉樣品中的膽固醇、甾醇、維生素等干擾物，而PSA和NH2類似，能有效去除樣品溶液中的極性基質（如脂肪酸、色素、糖類等）。通過實驗對比發(fā)現PSA吸附色素的效果比NH2好，因此選擇C18和PSA作為凈化劑。

圖2 不同凈化劑對17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物的回收率Fig.2 Recoveries of 17 neonicotinoid pesticides and their metabolites by different purification agents

2.5 基質效應

分別在空白樣品基質中添加2、5、10、20 ng/mL的混合標準溶液，采用本方法進行測定，以基質效應抑制率評價17種目標物的基質效應?；|效應抑制率=（溶劑中標準物質的定量離子響應強度-樣品基質中標準物質的定量離子響應強度）×100%/溶劑中標準物質的定量離子響應強度［23－24］。抑制率越接近0，表明基質效應越小，反之越大；抑制率為正值，表明存在基質抑制效應，負值則為基質增強效應。17種目標物在水果米粉（香蕉蘋果味）中的基質效應抑制率為11.4%～47.1%，蔬菜米粉（胡蘿卜菠菜味）中的基質效應抑制率為10.7%～44.8%，說明均存在不同程度的基質抑制效應。為減少不同基質對實際樣品檢測結果的影響，采用空白基質溶液配制標準曲線進行外標法校正。

2.6 線性關系、檢出限與定量下限

由“2.5”結果可知，水果米粉和蔬菜米粉的基質效應相差不大，本文選取蔬菜米粉基質空白提取溶液配制17種目標物的系列標準溶液，質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L。分別以各目標物質譜峰面積的平均值（Y）為縱坐標，對應質量濃度（X，μg/L）為橫坐標繪制標準曲線，并分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。由表2可見，17種目標物在對應的質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r）均大于0.995 4，LOD為0.02～0.15 μg/kg，LOQ為0.06～0.50 μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

表2 17種目標物的線性關系、檢出限及定量下限（n=6）Table 2 Linear relations，limits of detection and limits of quantitation for 17 analytes（n=6）

2.7 回收率與相對標準偏差

在水果和蔬菜米粉空白樣品中添加17種目標物的混合標準溶液，加標水平為LOQ、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg，采用本方法進行檢測，每個水平重復6次。由表3可見，3個加標水平下，17種目標物在水果米粉中的平均回收率為62.5%～103%，相對標準偏差（RSD）為3.5%～17%；蔬菜米粉中的平均回收率為66.4%～108%，RSD為4.3%～13%，表明該方法的準確度高、精密度好。

表3 17種目標物在米粉樣品中的平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of 17 analytes in spiked rice flour samples（n=6）

2.8 實際樣品檢測

采用本方法對10份果蔬米粉樣品進行檢測，在1份蔬菜米粉樣品中檢出啶蟲脒，含量為7.4 μg/kg。目前國家標準GB 2763－2021［25］尚未規(guī)定嬰幼兒果蔬米粉中新煙堿類殺蟲劑的最大殘留限量，由于嬰幼兒對其更敏感，建議國家盡快發(fā)布相關限量標準，以保護嬰幼兒身體健康。

3 結論

本文以易污染新煙堿類殺蟲劑殘留的嬰幼兒果蔬米粉為研究對象，C18和PSA為凈化劑，基于QuEChERS法，建立了高效液相色譜－串聯質譜快速測定嬰幼兒果蔬米粉中17種新煙堿類殺蟲劑及代謝物殘留的檢測方法。該方法靈敏、準確，可用于對嬰幼兒果蔬米粉中新煙堿類殺蟲劑殘留的監(jiān)管檢測。