不同的體外模擬消化方法對腌榨菜葉抗氧化活性的影響

黃師榮，閆 瑞，劉 歡，唐 敏，陳東方

（湘潭大學(xué) 化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

榨菜，學(xué)名莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee），是十字花科蕓薹屬芥菜種中的一種可食用變態(tài)莖變種[1]。其葉肉厚多汁，含有豐富的維生素、膳食纖維和礦物質(zhì)，常被用作橄欖菜和酸菜的原料[2]。據(jù)文獻(xiàn)報道，榨菜葉含有相當(dāng)數(shù)量的多酚類化合物，不僅具有較強的抗氧化作用，還具有預(yù)防和治療肺癌等功能[3]。由于榨菜葉組織脆嫩、含水量高，采后呼吸作用強，因而不易貯藏。采收后如不及時處理，短時間內(nèi)就會萎蔫、褪色、腐爛。腌制加工是長期保存蔬菜的方法之一[4]，也是保存芥菜中酚類物質(zhì)較好的方法[5]。榨菜葉經(jīng)腌制后，不但可以延長其貯存期，還賦予其獨特的風(fēng)味。所得產(chǎn)物具有解膩開胃、促消化、增食欲的功效。

雖然榨菜葉經(jīng)腌制后能很好地保留其中的酚類物質(zhì)，但是這些物質(zhì)被人體攝食后不一定能被人體完全利用，其在人體內(nèi)的利用率取決于從食物基質(zhì)中的釋放、在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性、腸道的吸收[6]等諸多因素。因此，研究消化過程對腌榨菜葉酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響，有助于進(jìn)一步了解其對人體的有益作用。文獻(xiàn)中常用體外模擬胃腸消化來研究食物中各種組分在人體內(nèi)的消化吸收情況，這種模型使用方便、快捷、使用成本較低而且重現(xiàn)性好。然而，有關(guān)體外模擬消化對腌榨菜葉中酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性影響的研究鮮有報道。

另一方面，文獻(xiàn)中報道了許多體外消化模型。這些模型所應(yīng)用的消化條件（如pH 值、消化時間、礦物質(zhì)類型、離子強度、所用酶的類型和來源等）不盡相同，所得試驗結(jié)果也不同[7]。然而，目前研究不同的體外消化模型對同一食物中酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性影響的文獻(xiàn)較少。為此，選用腌榨菜葉為原料，用6 種不同的體外模擬消化方法進(jìn)行消化，探究不同消化方法對腌榨葉酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響，有助于探究影響食物中酚類物質(zhì)生物可及性的因素，也有助于選擇研究食物中酚類物質(zhì)生物可及性的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）葉，湘潭市新塘灣菜業(yè)有限公司提供，將鮮榨菜葉曬蔫后用17%食鹽腌制20 d。

氯化鉀、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氯化鐵（均為分析純），西隴科學(xué)股份有限公司提供；氯化鈉、氯化鎂、碳酸銨、氯化鈣、甲醇、冰醋酸（均為分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；鹽酸、無水乙醇、丙酮，湖南匯虹試劑有限公司提供；α-淀粉酶（USP 級，1∶10 000）、胃蛋白酶（USP 級，1∶30 000），上海源葉生物科技有限公司提供；膽汁鹽、Trolox，美國Sigma 公司提供；福林酚試劑、ABTS，合肥博美生物科技有限公司提供；蘆丁、DPPH、香草醛、胰酶（USP 級，1∶4 000）等，上海麥克林生化科技有限公司提供；TPTZ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；其余化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

500B 型久品多功能粉碎機，永康市久品工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；Forma-86C 型超低溫冰箱，Thermo 公司產(chǎn)品；DL-6M 型大容量冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；THZ-82 型水浴恒溫振蕩器，金壇市易晨儀器制備有限公司產(chǎn)品；STRIKE 300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品；Agilent Cary60 型紫外可見分光光度計，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；FT-200 型高速分散均質(zhì)機，上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

將腌制好的榨菜葉晾曬至蔫狀后于40 ℃下烘干，粉碎后過60 目篩，裝于塑料自封袋中，于通風(fēng)干燥處避光保存?zhèn)溆谩?/p>

未消化樣品的制備參考Lee M A 等人[8]的方法并稍作改動，取5 g 腌榨菜葉粉與體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液100 mL 充分混合，于37 ℃下水浴振蕩2 h，然后以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心10 min 取上清液，重復(fù)提取3 次后合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃，以轉(zhuǎn)速100 r/min 蒸發(fā)濃縮后定容至30 mL，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 體外模擬胃腸消化

分別采用李斌等人[9]、姚軼俊等人[10]、曹卓陽等人[11]、Gawlik-Dziki U 等人[12]、Pellegrini M 等人[13]和Minekus M 等人[14]報道的方法并稍作修改，對腌榨菜葉進(jìn)行體外模擬口腔、胃和腸消化，研究其酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的變化情況，這些消化方法分別簡稱為M1、M2、M3、M4、M5 和M6。每種消化方法各消化階段結(jié)束后離心取上清液置于冰浴中10 min終止消化反應(yīng)，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

不同體外模擬消化方法的主要參數(shù)見表1，M6消化方法中模擬唾液、胃液和腸液組成見表2。

表1 不同體外模擬消化方法的主要參數(shù)

表2 M6 消化方法中模擬唾液、胃液和腸液組成

1.3.3 總酚含量的測定

參考Majhenic L 等人[15]的方法并稍做改動。取0.5 mL 樣品溶液，依次加入2.5 mL 福林酚試劑（用蒸餾水稀釋10 倍）和2 mL Na2CO3溶液（75 g/L），混勻后在50 ℃下保溫5 min，冷卻至室溫后于波長760 nm 處測定吸光度。以蒸餾水作空白對照，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品總酚含量表示為每克腌榨菜葉中含有沒食子酸的當(dāng)量毫克數(shù)（mg GAE/g）。

1.3.4 黃酮含量的測定

參考Cai Shengbao 等人[16]的方法并稍作修改。取1 mL 樣品液與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液4 mL 和5%亞硝酸鈉溶液1 mL 充分混勻，室溫下保持6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，反應(yīng)6 min 后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%氫氧化鈉溶液2 mL，振蕩混勻后室溫放置15 min，于波長510 nm 處測定吸光度。以60%乙醇為空白對照，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品黃酮含量表示為每克腌榨菜葉中含有蘆丁的當(dāng)量毫克數(shù)（mg RE/g）。

1.3.5 花青素含量的測定

參考Corona-Leo L S 等人[17]的方法并稍作修改。取1 mL 樣品，分別用氯化鉀緩沖液（pH 值1.0）和醋酸鈉緩沖液（pH 值4.5）定容至10 mL，在黑暗中靜置15 min，分別于波長510 nm 和700 nm 處測定每個樣品的吸光度。樣品中的花青素含量以相當(dāng)于矢車菊素-3 -葡萄糖苷含量表示，結(jié)果表示為每克腌榨菜葉中含有矢車菊素-3 -葡萄糖苷的當(dāng)量毫克數(shù)（mg C3GE/g）。總花青素含量計算公式如下：

式中：A——吸光度，A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5；

DF——稀釋系數(shù)（1∶10）；

MW——矢車菊素-3 -葡萄糖苷分子量（449.2 g/mol）；

ε——矢車菊素-3 -葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)（26 900 L·mol-1·cm-1）；

1——路徑長度，cm；

Wt——樣品質(zhì)量，g；

V——樣品體積，mL。

1.3.6 單寧含量的測定

參考李春陽等人[18]的方法并稍作修改。首先由1%香草醛溶液和8%鹽酸溶液以1∶1（V/V）的比例混合配制顯色劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。取1 mL 樣品溶液，加入5 mL 顯色劑后振蕩搖勻，在30 ℃恒溫水浴中避光保持30 min 后于波長500 nm 處測其吸光度。以蒸餾水作空白對照，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品中的單寧含量表示為每克腌榨菜中含有兒茶素的當(dāng)量毫克數(shù)（mg CE/g）。

1.3.7 ABTS 自由基清除能力的測定

參考Garzón G A 等人[19]的方法并稍作修改。將7 mmol/L ABTS 溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液以1∶1（V/V）的比例充分混勻，在室溫下避光靜置12～16 h 后，用甲醇調(diào)節(jié)其于波長734 nm 處吸光度為0.700±0.020 制得ABTS 儲備工作液。取0.3 mL樣品溶液與5.7 mL ABTS 儲備工作液振蕩搖勻，于室溫下避光反應(yīng)2 h，于波長734 nm 處測定吸光度。將樣品清除率換算成Trolox 摩爾濃度，結(jié)果表示為每克腌榨菜相當(dāng)于Trolox 的當(dāng)量微摩爾數(shù)（μmol TE/g）。ABTS 自由基清除率計算公式如下：

式中：A0——空白樣品的吸光度；

Ax——測試樣品的吸光度。

1.3.8 DPPH 自由基清除能力的測定

參考Liu Q 等人[20]的方法并稍作修改。取3 mL樣品溶液，加入0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液3 mL，振蕩搖勻，在室溫避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定其吸光度。將樣品清除率換算成Trolox 摩爾濃度，結(jié)果表示為每克腌榨菜相當(dāng)于Trolox 試劑的當(dāng)量微摩爾數(shù)（μmol TE/g）。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

式中：A0——空白樣品的吸光度；

Ae——測試樣品的吸光度。

1.3.9 鐵離子還原能力的測定

參考Thaipong K 等人[21]的方法并稍作修改。將0.3 mol/L 乙酸鈉緩沖液（pH 值3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1（V/V/V）的比例混合，配制成FRAP 工作試劑。取1 mL 樣品溶液，加入4.5 mL FRAP 工作試劑，充分混勻，在室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min，測定其于波長593 nm處的吸光度。將樣品鐵還原能力換算成Trolox 摩爾濃度，其結(jié)果表示為每克腌榨菜相當(dāng)于Trolox 的當(dāng)量微摩爾數(shù)（μmol TE/g）。鐵離子還原能力計算公式：

式中：A1——測試樣品的吸光度；

A2——空白樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個試驗重復(fù)2 次，通過Excel 2010、SPSS 19.0 和origin 8.5 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理，并將結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，同時采用ANOVA 進(jìn)行Duncan's 差異分析檢驗顯著性，以p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體外模擬消化方法對腌榨菜葉中酚類物質(zhì)含量的影響

不同體外模擬消化方法對腌榨菜葉總酚、黃酮、花青素和單寧含量的影響見表3。

表3 不同體外模擬消化方法對腌榨菜葉總酚、黃酮、花青素和單寧含量的影響

經(jīng)口腔消化后，6 種消化方法所得樣品的總酚含量較未消化樣品均顯著降低（p＜0.05，下同），可能是由于在口腔消化階段腌榨菜葉與消化液接觸時間較短，導(dǎo)致其中的酚類物質(zhì)釋放不充分。在經(jīng)不同方法消化的樣品中，M1 樣品總酚釋放量（約80%）最低，而M2 樣品釋放量（約93%）最大，M3 和M6 樣品與M2 樣品的釋放量相當(dāng)。這些差異可能是由于α -淀粉酶的含量及反應(yīng)時間的不同導(dǎo)致，M2中α -淀粉酶的酶活最大且反應(yīng)時間最長。在胃消化后，與未消化樣品（5.52 mg GAE/g）相比，M1 樣品的總酚含量差異不顯著（p＞0.05，下同），M6 樣品顯著增加，其他樣品則顯著下降；與口腔消化樣品相比，M4、M5 和M6 樣品的總酚含量顯著增加，分別增加了7.4%，8.7%，32.0%；M2 和M3 樣品分別損失了8.16%和10.76%的總酚，而M1 樣品則無顯著差異，推測可能是由于M6 中離子強度較大，促進(jìn)了酚類物質(zhì)的釋放，而M3 離子強度較小使酚類物質(zhì)降解或者轉(zhuǎn)發(fā)。在腸消化后，M4 樣品釋放的總酚含量較胃消化樣品無顯著差異，其他樣品則顯著增加，可能與M4 中胰酶濃度較低和消化時間較短有關(guān)。結(jié)果表明，腌榨菜葉經(jīng)M4 消化后各消化階段的總酚含量均顯著低于未消化樣品，可能是由于M4 方法中各消化階段消化酶含量較低及消化時間較短，導(dǎo)致樣品中總酚的不充分釋放。與未消化樣品相比，經(jīng)M4腸消化后腌榨菜葉中的總酚含量顯著降低，而經(jīng)其他方法消化的樣品總酚含量則顯著增加，其中M6 樣品的含量最高。文獻(xiàn)中也報道了許多不同的食物經(jīng)不同的方式消化后，其抗氧化物質(zhì)的變化情況不同。Ng Z X 等人[7]研究發(fā)現(xiàn)體外模擬消化降低了大多數(shù)功能性植物食品中的總酚和黃酮含量，而其他研究[22-23]則報道了食用植物和蔬菜汁在體外消化后的總酚含量增加。這種相互矛盾的結(jié)果據(jù)認(rèn)為可能是由于不同的食物種類、提取溶劑和消化方法產(chǎn)生的。

口腔消化后，M2 樣品的黃酮含量與未消化樣品無顯著差異，其他樣品則顯著減少，可能是由于M2中α -淀粉酶的酶活較大且反應(yīng)時間較長，使黃酮類物質(zhì)更多的釋放。在不同方法消化的樣品中，M2樣品的黃酮含量最高，而M5 的最低，M4 和M5 的差異不顯著。在胃消化后，M1 和M2 樣品的黃酮含量較未消化樣品無顯著差異，M6 樣品顯著增加，而M3、M4 和M5 樣品則比未消化樣品均顯著降低，可能是M3、M4 和M5 胃消化過程中樣品的黃酮類化合物高度代謝的緣故。除了M1、M4 和M6 樣品黃酮含量較口腔消化樣品顯著增加外，其他樣品則無顯著性變化。M6 樣品的黃酮含量最高，而M5 的最低。在腸消化后，M1、M2、M3 和M6 樣品黃酮含量較未消化和胃消化樣品均顯著增加，M4 樣品則顯著降低，M5 樣品的黃酮含量較胃消化顯著增加，但低于未消化樣品。結(jié)果表明，不同的消化方法對腌榨菜葉中黃酮類化合物的釋放會產(chǎn)生不同的影響，M1、M2、M3 和M6 消化后黃酮含量顯著高于M4 和M5，推測可能是由于M4 和M5 口腔消化階段缺少CaCl2溶液，不利于黃酮類化合物的釋放。

經(jīng)不同的口腔消化后腌榨菜葉的花青素含量變化與總酚含量變化趨勢一致，均較未消化樣品顯著降低。在胃消化后，M2 花青素含量較口腔消化無顯著差異，M3 顯著下降，其他樣品則顯著增加，其中M1 的含量最大，M2 和M3 的含量為0。在腸消化后，M1 和M6 花青素含量與未消化相比分別增加至3.55 和1.20 倍，其他樣品則顯著下降，其中M4 樣品的含量最低。M4 花青素含量與胃消化相比也顯著降低，其他樣品則顯著增加。

口腔消化后M2 和M6 的單寧含量與未消化相比差異不顯著，其他樣品則顯著降低，M1 降低最大，降低了43.69%。在胃消化后，M2 和M3 的單寧含量較口腔消化顯著降低，其他樣品則顯著增加；與未消化樣品相比，M5 的單寧含量顯著增加，M2 和M3顯著下降，其他樣品差異不顯著。在腸消化后，M4樣品的單寧含量與未消化樣品相比差異不顯著，其他樣品則顯著增加，其中M6 樣品增加最大，增加至3.51 倍。M4 在胃和腸消化階段單寧含量變化與未消化樣品（2.22 mg CE/g）均無顯著差異，可能是由于其消化酶含量較低，導(dǎo)致消化不完全。

綜上可以看出，腌榨菜葉經(jīng)6 種不同方法體外模擬消化后，M4 的酚類物質(zhì)含量最低，可能與其腸消化時間（1 h）較短有關(guān)；M6 消化后的多酚和單寧含量最高，可能與其離子強度較高有關(guān)；而M1 消化后的黃酮和花青素含量最高，可能與其腸胃消化的pH 值較高有關(guān)。結(jié)果表明，不同的消化方法對食物的酚類物質(zhì)含量變化影響很大。

2.2 不同體外模擬消化方法對腌榨菜葉抗氧化活性的影響

不同體外模擬消化方法對腌榨菜抗氧化能力的影響見表4。

表4 不同體外模擬消化方法對腌榨菜抗氧化能力的影響

在口腔消化后，不同方法消化的腌榨菜葉的ABTS 自由基清除能力均顯著低于未消化樣品的，M6樣品的清除能力最大，M2 的最小，M4 與M2 的值相當(dāng)。在胃消化后，M2 和M3 樣品的ABTS 自由基清除能力與口腔消化樣品相比顯著降低，其他樣品則顯著增加，M6 樣品增加最大，增加了28.6%；經(jīng)胃消化后，M6 樣品的ABTS 自由基清除能力與未消化樣品的相當(dāng)，其他樣品顯著低于未消化樣品。腸消化后，除M4 樣品比胃消化樣品的ABTS 自由基清除能力顯著降低外，其他樣品的清除能力均顯著增加；與未消化相比，M1 和M6 的ABTS 自由基清除能力顯著增加，其他樣品則顯著降低，M6 樣品增加最大，增加了3.64 倍，M4 樣品下降最大，下降了61.8%。

在口腔消化后，M4 樣品的DPPH 自由基清除能力與未消化樣品相比無顯著差異，M6 樣品顯著降低，而其他樣品則均顯著增加；M3 增加最大，增加了59.1%。在胃消化后，M2 和M3 樣品比口腔消化樣品的DPPH 自由基清除能力顯著降低，其他樣品則顯著增加，M4 樣品增加最大，增加了106.3%，其次分別為M6、M5 和M1；經(jīng)胃消化后，所有消化樣品的DPPH 自由基清除能力均顯著高于未消化樣品。腸消化后，除M4 樣品的DPPH 自由基清除能力較胃消化樣品顯著降低外，其他樣品均顯著增加，M2 樣品增加最大，增加了145.8%，其次分別為M3、M6、M1 和M5；與未消化樣品相比，經(jīng)6 種不同的腸消化方法后樣品的DPPH 自由基清除能力均顯著增加，M2 增加最大，M3 與M2 無顯著差異，M4 增加最小，M5 與M5 無顯著差異。

經(jīng)口腔消化后，所有消化樣品的FRAP 均顯著低于未消化樣品。在胃消化后，M2 和M5 的FRAP與口腔消化相比均無顯著差異，M3 顯著降低，其他樣品則顯著增加，M6 增加最大，其次分別為M1 和M4；與未消化樣品相比，除M6 樣品顯著增加外，其他消化樣品均顯著下降，M2 下降最大。腸消化后，除M4 樣品的FRAP 較胃消化樣品顯著降低外，其他消化樣品的FRAP 值均顯著增加，M2 樣品增加最大，其次分別為M1、M3、M5 和M6 樣品。經(jīng)腸消化后，M5 的FRAP 與未消化相比無顯著差異，M1、M2 和M6 的FRAP 顯著增加，M3 和M4 則顯著降低；M2 增加最大，增加了50.3%，M4 下降最大，下降了31.9%。

結(jié)果表明，腌榨菜葉經(jīng)6 種不同方法體外模擬消化后，M4 的3 種抗氧化活性均最低，這與其酚類物質(zhì)含量最低相一致；M6 的ABTS 自由基清除能力最強，與其多酚和單寧含量最高相一致；M2 的DPPH 自由基清除能力和FRAP 最強，與其黃酮含量較高相一致。但也有一些消化方法所得的抗氧化活性與其酚類物質(zhì)含量相關(guān)性不高，可能是由于除了酚類物質(zhì)以外的抗氧化物質(zhì)造成的，如多糖或者其他具有供氫特性的次生代謝物等[22-23]。

2.3 相關(guān)性分析

腌榨菜葉經(jīng)6 種不同體外模擬方法消化后總酚、黃酮、花青素及單寧含量與其抗氧化活性之間的相關(guān)性分析見表5。

由表5 可知，腌榨菜葉經(jīng)6 種不同體外模擬方法消化后的總酚、黃酮、花青素、單寧含量與ABTS和DPPH 自由基清除活性相關(guān)性極顯著（p＜0.01），其中M1 樣品中的黃酮與ABTS 自由基清除活性相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為1.000；M6 樣品中的黃酮與FRAP 相關(guān)性最小，相關(guān)系數(shù)為0.808。除M4 樣品中的花青素含量與FRAP，以及M6 樣品中的總酚、花青素和丹寧含量與FRAP 相關(guān)性顯著（p＜0.05）外，腌榨菜葉經(jīng)6 種不同體外模擬方法消化后的總酚、黃酮、花青素、單寧含量與FRAP 相關(guān)性均極顯著（p＜0.01）。不同體外模擬消化樣品的酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，各消化樣品的總酚、黃酮、花青素和單寧含量與其抗氧化活性密切相關(guān)，是影響其消化過程中抗氧化活性變化的關(guān)鍵因素。

表5 腌榨菜葉經(jīng)6 種不同體外模擬方法消化后總酚、黃酮、花青素及單寧含量與其抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

評估了6 種不同體外模擬消化方法對腌榨菜葉的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)體外模擬消化方法對腌榨菜葉的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性影響很大。M4 消化后的酚類物質(zhì)含量和ABTS、DPPH 自由基清除能力和FRAP 均最低；M1 消化后黃酮和花青素含量最高；M2 消化后的DPPH 自由基清除能力和FRAP 最大；M6 消化后的多酚和單寧含量最高，ABTS 自由基清除能力最大。說明不同的消化方法對樣品消化后抗氧化活性產(chǎn)生不同的影響，對其產(chǎn)生不同影響的原因尚未可知，需要進(jìn)一步深入研究探討。