殼聚糖酶及其應(yīng)用研究新進(jìn)展

孫亞男，張付云

（大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

高效、高附加值地利用豐富的可再生生物質(zhì)資源對(duì)可持續(xù)生物經(jīng)濟(jì)至關(guān)重要，是現(xiàn)代社會(huì)的主要目標(biāo)[1]。幾丁質(zhì)是第二大天然有機(jī)可再生資源，廣泛分布于生物體內(nèi)[2]。殼聚糖是幾丁質(zhì)的脫乙?；a(chǎn)物[3]，具有多種生物活性，其分子量大、水溶性差，極大地限制了其應(yīng)用和商業(yè)化發(fā)展[4]。相比之下，殼寡糖（Chitosanoligosaccharide/Chitooligosaccharide，COS）具有較低的分子量和黏度，以及更好的水溶性，在一些研究中，COS 表現(xiàn)出更好的抗真菌和抗病毒活性，以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力等[5-6]。

COS 是殼聚糖的降解產(chǎn)物，是唯一帶正電荷的天然低聚糖。COS 可以通過(guò)化學(xué)、物理和酶降解制備[7]。酶法與其他2 種方法相比具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、選擇性好、可控性和重現(xiàn)性好、對(duì)環(huán)境有益等優(yōu)點(diǎn)。具有特殊性質(zhì)的酶在工業(yè)生產(chǎn)中受到青睞。由于聚合度（DP）直接影響COS 的生物活性，因此對(duì)殼聚糖酶的研究至關(guān)重要，對(duì)酶的來(lái)源、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用等方面進(jìn)行概述。

1 天然殼聚糖酶來(lái)源

近年來(lái)，對(duì)細(xì)菌來(lái)源的殼聚糖酶研究頗多，包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），沙雷氏菌屬（Serratia sp.），鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.），其中Bacillus sp.的來(lái)源最多。除了這些常見(jiàn)的菌種，來(lái)源于新菌種的殼聚糖酶逐漸被研究者熟知。Ma Qinyuan 等人[8]從多個(gè)城市采集了土壤樣品并利用顏色指示劑和酶活的跟蹤測(cè)定進(jìn)行了2 次篩選，發(fā)現(xiàn)R.equiF6 表現(xiàn)出最大活性，其菌落呈現(xiàn)淡粉色、圓形、光滑、不透明、發(fā)亮和黏液狀。生理、生化和16S rDNA 序列分析得出F6 菌株被歸類為紅球菌屬與幾種馬紅球菌菌株具有100%的同源性。王琦等人[9]克隆了來(lái)源于Butyrivibrio sp.MC2013 編碼的殼聚糖酶基因序列并命名為BUT，其與其他GH46 家族的殼聚糖酶相似度最高達(dá)59%且無(wú)分支出現(xiàn)。Qin Zhen 等人[10]從Gynuella sunshinyiiYC6258 基因組中鑒定GH46 家族假設(shè)蛋白基因并合成，BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)GsCsn46A 氨基酸序列與Bacillus nakamurai表達(dá)殼聚糖酶同源性最高且是具有GH46 家族催化結(jié)構(gòu)域的單一模塊化蛋白。Wang Yanxin 等人[11]利用Aquabacterium sp.A7-Y 基因組克隆出新的屬于GH5 家族的內(nèi)切殼聚糖酶——AqCoA，其與來(lái)自Polyangium brachysporum的GH5 家族纖維素酶具有高度的序列相似性。此外，通過(guò)挖掘或已知的方式也可獲得殼聚糖酶。Yang Guosong 等人[12]通過(guò)使用BLASTP 程序和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘序列數(shù)據(jù)得到了來(lái)自Bacilus sp.MD-5 的csn-bac 基因。Luo Sa等人[13]利用已知序列的B.Amyloliquefaciens克隆出BaCsn46B 基因。Cui Dandan 等人[14]利用B.atrophaeusBSS 序列克隆出屬于GH46 家族的Csn-SH 酶。

相比于細(xì)菌，真菌來(lái)源的殼聚糖酶較少，其作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道，原因是真菌來(lái)源的殼聚糖酶活性低于來(lái)源于細(xì)菌的。Qu Tianle 等人[15]從曲醬油的孢子中分離出來(lái)A.oryzae并在PDB 瓊脂平板中大量培養(yǎng)，提取出總RNA 后獲得的cDNA 克隆出一個(gè)新的GH20 家族β-N-乙酰己糖胺酶基因-AoNagase 基因，但其折疊方式不同于GH20 家族其他成員。Gleb E.Aktuganov 等人[16]通過(guò)篩選殼聚糖降解微生物分離出真菌菌株IB-37-2A，通過(guò)BLAST 比對(duì)和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示出與P.janthinellum進(jìn)化枝中包含的幾種青霉屬物種的最大同源性。

除了從菌株中獲得降解殼聚糖的基因，還有從基因組文庫(kù)中挖掘降解殼聚糖的基因。Guan Feifei等人[17]從海洋宏基因組中篩選出CDA20 和CHIS5，分別屬于CE4_SF 超家族和Glyco_hydro_46 家族，二者與ChbG/HPNK 家族脫乙?；负蛠?lái)自Sphaerisporangium albumin的殼聚糖酶有高同源性且協(xié)同作用于殼聚糖。

2 殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)

聚糖酶的最適溫度主要在30～60 ℃。Qin Zhen等人[10]和Sun Huihui 等人[18]異源表達(dá)了嗜冷性殼聚糖酶，分別為GsCsn46A 和Csn-CAP，它們分別在15 ℃和20 ℃表現(xiàn)出70%和86%的最大活性。Qu Tianle等人[15]和Jiang Zhenqiang 等人[19]異源表達(dá)分別得到了嗜熱性殼聚糖酶-AoNagase 和PbCsn8，它們的最適溫度分別高達(dá)65 ℃和70 ℃。熱穩(wěn)定性高的殼聚糖酶因其眾多的優(yōu)勢(shì)，使得在工業(yè)生產(chǎn)中受到極大關(guān)注，但相關(guān)方面的報(bào)道較少。Chen X 等人[20]克隆了來(lái)源于Aspergillus fumigatus的殼聚糖酶基因并在畢赤酵母GS115 中高效表達(dá)，最終得到熱穩(wěn)定性極高的新殼聚糖酶，對(duì)其特性研究發(fā)現(xiàn)在80，90，100 ℃的半衰期分別為2.5，1.0 h，30 min。

殼聚糖酶最適pH 值為4.0～8.0。Guo Na 等人[21]克隆Streptomyces albolongusATCC 27414 基因并異源表達(dá)得到了Csn21c，其最適pH 值為8.0，屬于堿性酶。Zheng Qiuling 等人[22]得到了新的殼聚糖酶-CsnS，其最適pH 值為5.8，為偏酸性的酶。

金屬離子會(huì)對(duì)改造后的殼聚糖酶活性產(chǎn)生影響。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+會(huì)促進(jìn)殼聚糖酶降解殼聚糖，K+、Fe2+、Hg2+、Ni2+會(huì)抑制殼聚糖酶降解殼聚糖。Huang Zhen 等人[23]對(duì)殼聚糖酶celA1805的特性研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L Ni2+使酶活性增加到111.2%，而Mn2+使活性受到了抑制。

3 提高酶活性方法

野生菌株表達(dá)的殼聚糖酶因其酶活性和穩(wěn)定性不高而不能廣泛使用。近年來(lái)，許多文獻(xiàn)從不同的方向報(bào)道了不同的方法以提高酶活性和穩(wěn)定性。

首先，從分子角度對(duì)野生菌株的基因進(jìn)行改變。張朝正等人[24]使用常溫常壓等離子體（ARTP）誘變蠟狀芽孢桿菌并篩選殼聚糖酶活性提高的菌株，試驗(yàn)結(jié)果表明此方法可以篩選到酶活性提高13.19%的突變菌株且酶活穩(wěn)定性波動(dòng)不大，僅在5%之內(nèi)。該方法不改變菌落形態(tài)，但改變菌株的個(gè)體形態(tài)而且當(dāng)誘變時(shí)間達(dá)到60 s 會(huì)造成蠟狀芽孢桿菌90%以上的致死率。程功等人[25-26]使用畢赤酵母偏好的密碼子優(yōu)化了環(huán)狀芽胞桿菌株MH-K1 編碼殼聚糖酶的基因序列，以使畢赤酵母高效表達(dá)殼聚糖酶。也使用該方法優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌株FZB42 編碼殼聚糖酶的基因序列并在畢赤酵母中高效表達(dá)，酶解殼聚糖的結(jié)果表明殼寡糖的末端結(jié)構(gòu)為氨基葡萄糖。

其次，優(yōu)化酶解反應(yīng)條件。Li Meng 等人[27]采用過(guò)氧化氫預(yù)處理分散在去離子水中的殼聚糖粉末，以快速降低殼聚糖溶液的黏度，從而使殼聚糖溶解更多。使用此方法通過(guò)補(bǔ)料分批殼聚糖成功制備了高濃度（9%，W/V）的殼聚糖溶液。Nur Rokhati 等人[28]使用低濃度的吐溫80 提高了殼聚糖的水解速率且水解時(shí)間在24 h 之內(nèi)。

再次，優(yōu)化培養(yǎng)條件以提高殼聚糖酶活性。毛貴珠等人[29]對(duì)鹿皮色曲霉產(chǎn)殼聚糖酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了培養(yǎng)基成分：膠體殼聚糖1.5%，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，發(fā)酵周期為96 h，該菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性是優(yōu)化前的2.36 倍。王俊芳等人[30]經(jīng)紫外和微波誘變枯草芽孢桿菌后選取了高產(chǎn)酶菌株并優(yōu)化了培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，研究表明培養(yǎng)基成分為果糖1.3%，膠體殼聚糖0.5%，酵母粉2.0%，MgSO4·7H2O 0.3%和培養(yǎng)條件為初始pH 值7.2，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min 能得到酶活比優(yōu)化前提高6.9 倍的殼聚糖酶。熊妍妍等人[31]利用冷源等離子體誘變了鹿皮曲霉ZJOU-AC1，得到了酶活力提高了50.7%的殼聚糖酶并確定了最佳發(fā)酵條件為溫度30 ℃，初始pH 值6.0，發(fā)酵時(shí)間80 h，接種量3%。

4 殼聚糖酶的應(yīng)用

海產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展使得蝦、蟹等甲殼類動(dòng)物大量消費(fèi)，全球產(chǎn)生了高達(dá)幾噸的貝類廢物。貝類廢物富含幾丁質(zhì)等有價(jià)值的副產(chǎn)物。然而使用化學(xué)方法處理會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)有害，使得酶法降解發(fā)揮了重要作用。Gincy Marina Mathew 等人[32]總結(jié)了包括殼聚糖酶在內(nèi)各種酶對(duì)副產(chǎn)物的降解。貝類廢物，如蝦（對(duì)蝦、蝦、龍蝦、南極磷蝦）殼、蟹殼，首先使用商業(yè)酶，如堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶產(chǎn)生者（如桿菌屬）進(jìn)行脫蛋白作用產(chǎn)生幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)分別被幾丁質(zhì)酶、甲殼素脫乙酰酶降解為殼寡糖（COS）、殼聚糖。殼聚糖和殼寡糖分別被殼聚糖酶、甲殼素低聚糖脫乙酰酶（COD）降解為部分乙?；牡蜌す烟牵╬aCOS）。

植物抗病研究一直是研究熱點(diǎn)，使用生物方法不僅可以有效提高植物對(duì)病原菌的抗性，還可以起到保護(hù)生態(tài)環(huán)境的作用。來(lái)源于Chromobacterium violaceumATCC 12472 的殼聚糖酶-CvCsn46 產(chǎn)生的殼聚糖寡聚體抑制擬南芥的菌絲體生長(zhǎng)，顯著減少菌絲體延伸并誘導(dǎo)菌絲形態(tài)改變[33]。

5 結(jié)語(yǔ)

殼寡糖具有分子量小、易溶于水的特點(diǎn)且因其的多種生理活性，在許多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。殼聚糖通過(guò)酶法降解為殼寡糖一直是研究熱點(diǎn)，而殼聚糖酶作為高效降解殼聚糖的酶?jìng)涫荜P(guān)注。殼聚糖酶在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用大部分決定于高活性酶的開(kāi)發(fā)及成本[34]。野生菌株表達(dá)殼聚糖酶因產(chǎn)量低、活性低、來(lái)源有限、穩(wěn)定性差而阻礙其生產(chǎn)及商品化應(yīng)用。所以，一方面繼續(xù)尋找合適的新野生菌株以作為起點(diǎn)；另一方面深入研究殼聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從宏觀和分子水平對(duì)野生菌株的殼聚糖酶進(jìn)行定向化處理，從而產(chǎn)生高活性和穩(wěn)定性的新殼聚糖酶，以符合生產(chǎn)生活需求。