基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的風(fēng)熱感冒顆粒質(zhì)量評價(jià)

夏鵬飛 李開斌 王曉雁 趙室梅 龍麗娜 鮑 娟

貴州省安順市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 安順 561000

風(fēng)熱感冒顆粒(fengre ganmao granule，F(xiàn)GG)是由桑葉、連翹、菊花、牛蒡子等十一味中藥制成的顆粒劑，具有清熱解表，宣肺利咽之功效，主要用于由感冒引起的身熱、鼻塞、頭痛、咳嗽、多痰等癥[1]，F(xiàn)GG收錄于衛(wèi)生部中藥成方制劑，標(biāo)準(zhǔn)中僅對FGG的顆粒通用檢測項(xiàng)進(jìn)行質(zhì)量控制，目前有文獻(xiàn)[2-4]報(bào)道對FGG所含綠原酸、連翹苷、牛蒡苷等成分進(jìn)行定量測定的研究，尚未發(fā)現(xiàn)對FGG指紋圖譜建立及結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析相關(guān)的報(bào)道，中藥復(fù)方制劑具有成分多樣性、復(fù)雜性、成效整體性等特點(diǎn)，只針對某幾種成分定量測定對全面反映其整體質(zhì)量仍具有局限性，本實(shí)驗(yàn)以中藥指紋圖譜結(jié)合聚類分析(HCA)方法將指紋圖譜提供的信息進(jìn)行再評價(jià)，多角度把中藥制劑的隱藏規(guī)律表達(dá)出來，避免主觀上的加權(quán)，為更加全面研究FGG整體質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器(DAD)、安捷倫工作站(Agilent公司)；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XSE105型十萬分之一電子天平(梅特勒托利多有限公司)。

1.2 材料 綠原酸(批號110753-201817，含量96.8%)、蘆丁(批號100080-201811，含量92.4%)、連翹苷(批號110821-201816，含量95.1%)、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?批號111782-201405，含量92.4%)和牛蒡苷(批號110819-201812，含量95.0%)均來源于中國食品藥品檢定研究院。色譜乙腈(Fisher公司)、水為超純水、磷酸為分析純。

風(fēng)熱感冒顆粒生產(chǎn)廠家及批次：貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司，批號：B20200501；通化仁民藥業(yè)(中大)股份有限公司，批號:200702；康縣獨(dú)一味生物制藥有限公司，批號：2011392301；通化仁民藥業(yè)(德濟(jì))股份有限公司，批號:200507；廣東恒誠制藥(恒誠)股份有限公司，批號:2004210；株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號：20190801；蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：20054；云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：ZEA2004；廣東恒誠制藥(南海)股份有限公司，批號：1909204；山東孔府制藥股份有限公司，批號：20200103，上述10批樣品按順序編號s1～s10。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫20 ℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～11.0 min，10.0%～15.0%乙腈；15.0～30.0 min，15.0%～18.0%乙腈；30.0～50.0 min，18.0%～40.0%乙腈；50.0～51.0 min，40.0%～11.0%乙腈；51.0～60.0 min，10.0%乙腈；流速：1.0 mL/min；檢測波長為330 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品綠原酸、蘆丁、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、連翹苷、牛蒡苷各適量，用50%甲醇溶液制成濃度分別為0.2089 mg/mL、0.2122 mg/mL、0.1955 mg/mL、0.2975 mg/mL、1.4580 mg/mL的對照品儲備液；精密吸取各對照品儲備液2 mL至25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，制成濃度分別為綠原酸16.71 μg/mL、蘆丁16.97 μg/mL、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?5.64 μg/mL、連翹苷23.80 μg/mL、牛蒡苷58.32 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取FGG 約10 g，研細(xì)，取5.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液30 mL，超聲30 min，放冷，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取FGG(編號S1)，按“2.2.2”方法制得供試品溶液，依法連續(xù)測定6次，選出出峰穩(wěn)定、響應(yīng)值高、峰面積大、分離度較好的14號峰(牛蒡苷)作為參照峰，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對峰面積與相對保留時(shí)間RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取FGG(編號S1)，按“2.2.2”方法制得供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h依法進(jìn)樣測定，以14號峰為參照峰，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對峰面積與相對保留時(shí)間RSD均小于3.0%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取FGG(編號S1)，按“2.2.2”方法制備6份平行供試品溶液，以14號峰為參照峰，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4 指紋圖譜的建立與相關(guān)性分析

2.4.1 FGG指紋圖譜的建立 取10批不同廠家次FGG，以“2.2.2”方法制備供試品溶液，按“2.1”方法測定，導(dǎo)入2012.130723版中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件，樣品S1圖譜作參照圖譜，以平均數(shù)法加以多點(diǎn)校正建立指紋圖譜。色譜圖如圖1所示 。

圖1 10批FGG HPLC指紋圖譜(S1～S10)和對照指紋圖譜(R)

2.4.2 FGG相似度分析 通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2012.130723版)進(jìn)行比對，10批FGG指紋圖譜相似度分別為0.973、0.930、0.985、0.881、0.950、0.991、0.988、0.990、0.970、0.955，范圍為0.881～0.991，有8個(gè)批次的相似度大于0.95，有1個(gè)批次相似度較低為0.881，說明大部分廠家FGG質(zhì)量均一，少部分存在差異。

2.4.3 主要特征峰歸屬 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各對照品儲備液，依法進(jìn)樣測定，與指紋圖譜各共有峰進(jìn)行指認(rèn)，標(biāo)示出5個(gè)色譜峰，分別為2號峰綠原酸、6 號峰蘆丁、10號峰3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、13 號峰連翹酯、14號峰牛蒡苷，色譜圖如圖2。

圖2 混合對照品色譜圖

2.5 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的FGG質(zhì)量分析 HCA是通過集合分組將類似的對象組成的多個(gè)類的分析過程，能對相似關(guān)系進(jìn)行分類，對中藥與中藥制劑質(zhì)量研究有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)以峰面積與相對峰面積為變量，考察其制劑整體成分含量與組分比例情況，對10個(gè)不同批次FGG樣品的測定數(shù)據(jù)，以Euclidean距離為測度采用SPSS26.0軟件組間聯(lián)接進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3 。當(dāng)以樣品峰面積(A樣/W樣)(見表2)為變量，以較大類間距離25時(shí)10批樣品可聚為兩類，S2、S4、S3、S5、S9、S10為第Ⅰ類,S7、S8、S1、S6為第Ⅱ類，結(jié)果表明10批FGG在成分含量上可分為差異較大的兩類樣本。當(dāng)以相對峰面積(見表3)為變量時(shí)，以5為類間距離，10批樣品可聚為3類，S3、S6、S7 、S8、S10、S5、S9為第Ⅰ類、S2為第Ⅱ類、S4為第Ⅲ類，當(dāng)類間距離為10時(shí)，10批樣品可聚為2類，S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10為第Ⅰ類，S4為第Ⅱ類，結(jié)果表明10批FGG在成分組成比例上具有較強(qiáng)的相似性。

(a)峰面積(A樣/W樣)為變量 (b)相對峰面積為變量

表2 10批FGG HPLC指紋圖譜共有峰峰面積(A樣/W樣)

表2(續(xù))

表3 10批FGG HPLC指紋圖譜共有峰相對峰面積

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)在選擇流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水[5]。結(jié)果表明，乙腈-水分離效果優(yōu)于甲醇-水，通過在水相中加入的磷酸溶液[6],能改善大部分峰形，最終確定以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，峰形與分離度好。在波長選擇上，參考文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)GG內(nèi)含多個(gè)成分在330 nm處有較好的吸收[7-8]，同時(shí)運(yùn)用PDA檢測器進(jìn)行全波段掃描，最終選擇出峰較為全面的330 nm作為檢測波長。

3.2 結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)通過建立指紋圖譜對10批FGG進(jìn)行相似度與HCA綜合評價(jià)，指紋圖譜相似度結(jié)果與當(dāng)相對峰面積為變量類間距為5時(shí)HCA分類結(jié)果相一致，指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果數(shù)據(jù)直接明了，而HCA可通過類間距測度不同，細(xì)分程度更靈活多變，能提供可視化的聚類樹狀圖評估樣本組內(nèi)外差異，直觀分析其樣本之間相似程度，同時(shí)HCA能引入更多變量對樣本進(jìn)行分析，當(dāng)在HCA中引入峰面積(A樣/W樣)為變量時(shí)，聚類樹狀圖顯示了FGG在成分含量上存在的整體差異情況。綜合數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以得出，10批FGG雖然在組成比例上相似程度較高，但在組成含量上樣品存在較大差異，可分為差異較大的兩類，反映了10批FGG整體質(zhì)量存在一定差異，產(chǎn)生的原因可能與不同廠家FGG原藥材來源、采收加工、制劑生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)，同時(shí)也可能存在FGG國家標(biāo)準(zhǔn)對質(zhì)量控制不夠全面，生產(chǎn)廠家存在一定主觀故意性，反映FGG有必要建立一套完整、可靠、科學(xué)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，以使其產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。中藥及中藥制劑發(fā)展需要質(zhì)量穩(wěn)定、科學(xué)的檢測方法，中藥及其制劑成分存在復(fù)雜多樣性，目前指紋圖譜的應(yīng)用越發(fā)廣泛，化學(xué)計(jì)量方法的運(yùn)用能簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，利于分析，多方法的結(jié)合對中藥質(zhì)量控制評價(jià)有積極的參考意義。