單糖特征分析在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎病原菌診斷中的價(jià)值

公智卿，陳懌鵬，盧冬梅，辛麗麗，郭 菁，邢廣群

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病科，山東 青島 266555)

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎(peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP)是腹膜透析常見的并發(fā)癥，可以影響腹膜的結(jié)構(gòu)和功能，并引起腹膜透析技術(shù)失敗以及嚴(yán)重的包裹硬化性腹膜炎，危及患者生命。對(duì)病原體的及時(shí)精準(zhǔn)診斷、盡早選用敏感的抗生素是最有效的措施[1-2]。腹膜炎的主要致病菌有細(xì)菌和真菌，覆蓋細(xì)菌表面的復(fù)雜多聚糖網(wǎng)絡(luò)在革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌之間是不同的，革蘭陰性菌被兩層細(xì)胞膜包裹，兩層細(xì)胞膜被一層肽聚糖層隔開，并在外膜中含有脂多糖。相比之下，革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞膜只有厚厚的肽聚糖層覆蓋[3]。細(xì)菌多糖通常是由雙糖至八糖形成的規(guī)則的重復(fù)單位構(gòu)成，這些聚糖的精確結(jié)構(gòu)可能在具有相同細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的細(xì)菌之間存在顯著差異，甚至在同一細(xì)菌物種的不同菌株之間也可能存在差異[4]。構(gòu)成細(xì)菌常見的單糖有甘露糖、葡萄糖、巖藻糖等。革蘭陰性菌中含有的脂多糖是由脂質(zhì)A，核心多糖和O抗原組成的脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，Milan Manani等[5]研究表明，革蘭陰性菌腹膜炎患者的透析液中脂多糖水平較革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎腹透液和正常腹透液顯著升高。真菌細(xì)胞壁中含有半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖，其在真菌生長(zhǎng)和組織侵襲過程中會(huì)釋放到周圍環(huán)境中，Worasilchai等[6]研究表明，檢測(cè)腹膜透析液中半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖的含量可以作為真菌性腹膜炎的早期診斷。

目前對(duì)腹膜炎患者腹膜透析液中單糖研究較少，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)具有應(yīng)用范圍廣、分析速度快、敏感度高和耐鹽污染等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于降解后單糖含量測(cè)定、食品中成分測(cè)定、藥物含量測(cè)定等領(lǐng)域[7]。Trezzi 等[8]應(yīng)用色譜法研究表明，測(cè)定腦脊液中單糖成分變化可以用于早期診斷帕金森病。因此，本研究將應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)腹膜透析液中由多聚糖降解后的單糖水平進(jìn)行分析，探究腹膜透析相關(guān)性腹膜炎患者腹透液中單糖水平的差異。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2020年10月01日到2021年10月31日到青島大學(xué)附屬醫(yī)院西海岸腎病科住院的透析齡>3個(gè)月、年齡≥18歲的腹膜透析患者90例，收集患者腹膜透析液樣本，包括無(wú)腹膜炎腹膜透析液樣本52個(gè)，腹膜炎腹膜透析液樣本38個(gè)，其中革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎腹膜透析液樣本24個(gè)，革蘭陰性菌腹膜炎腹膜透析液樣本14個(gè)。PDAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2022年國(guó)際腹膜透析協(xié)會(huì) (ISPD)指南, 符合以下3項(xiàng)中2項(xiàng)及以上者可診斷為PDAP：(1)腹痛和(或)透出液渾濁，伴或不伴發(fā)熱；(2)透出液白細(xì)胞計(jì)數(shù)超過100×106/L，其中多形核中性粒細(xì)胞達(dá)50%以上；(3)透出液微生物培養(yǎng)陽(yáng)性[1]。本研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批文號(hào)：QYFYWZLL26672)。

1.2實(shí)驗(yàn)與方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀(T100 Thermal cycler)購(gòu)于新加坡Thermal Cycler公司；渦旋振蕩器(VG 3 S25, VORTEX GENIUS3)購(gòu)于德國(guó)IKA 儀器設(shè)備有限公司；掌上離心機(jī)(LX-100)購(gòu)于江蘇其林貝爾儀器有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；磁力攪拌器(C-MAG HS7)購(gòu)于德國(guó)IKA 儀器設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 1260/1290)、Eclipse XD B-C18 色譜柱(150 mm*4.6 mm，5 μm)購(gòu)于美國(guó)Agilent公司；超聲波振動(dòng)清洗器(KH7200E)購(gòu)于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；電子天平(TP-213 型)購(gòu)于北京丹佛儀器有限公司；PH 計(jì)(雷磁 PHs-3C)購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司；Simplicity UV 純水儀購(gòu)于德國(guó)Millipore公司；烘箱購(gòu)于上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 三氯甲烷購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich 公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，色譜甲醇、乙腈、甲醇均購(gòu)于Merck公司濃鹽酸溶液、NaOH溶液、乙酸銨、冰醋酸均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.3方法 留取無(wú)腹膜炎患者入院當(dāng)天腹透液和腹膜炎患者初入院經(jīng)驗(yàn)性抗生素使用之前的第一袋1.5%葡萄糖濃度的腹膜透析液，無(wú)菌操作采集患者留腹>2 h的腹膜透析液20 ml，放入-80 ℃冰箱中保存，同時(shí)抽取20 ml注入需氧、厭氧血培養(yǎng)瓶中。將所有收集的腹膜透析液樣本一式三份，測(cè)定3次單糖濃度取平均值。取5 μl腹膜透析液加入八連管的底部。八連管加蓋后放入PCR儀中，溫度設(shè)置為100 ℃, 降解10 min。經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)處理后，最終取50 μl上清液于棕色上樣瓶?jī)?nèi)，隨后用HPLC進(jìn)行色譜分析[檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；色譜柱溫37 ℃；進(jìn)樣量20 μl；流速1 ml/min；流動(dòng)相配置：85%乙酸銨-乙酸緩沖溶液(PH=5.5)、15%乙腈][9]。

2 結(jié) 果

2.13組臨床資料比較 腹膜炎組與無(wú)腹膜炎組在體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、白蛋白、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血鈉、血鈣、血磷上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。腹膜炎組與無(wú)腹膜炎組甘露糖、葡萄糖和巖藻糖的濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎組與革蘭陰性菌腹膜炎組甘露糖濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見表1～2。 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎病原菌構(gòu)成見表3。

表1 3組臨床資料比較

表2 腹膜透析液降解單糖濃度比較(μmol/L)

表3 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎病原菌構(gòu)成情況

2.2Logistic回歸分析 對(duì)無(wú)腹膜炎組和腹膜炎組進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析示，巖藻糖濃度是腹膜炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01), 見表4。對(duì)革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎組和革蘭陰性菌腹膜炎組進(jìn)行亞組分析，根據(jù)ROC曲線結(jié)果，對(duì)甘露糖濃度進(jìn)行賦值后行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果表明甘露糖濃度是革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01), 見表5～6。

表4 腹膜炎影響因素的logistic回歸分析

表5 變量賦值說明

表6 革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎影響因素的logistic回歸分析

2.3ROC曲線分析 降解的巖藻糖診斷腹膜炎的AUC是0.820，95%CI(0.732，0.908)，敏感度為71.05%，特異度為84.62%，最佳截?cái)嘀禐?.045 μmol/L。降解甘露糖對(duì)革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎診斷的AUC是0.863, 95%CI(0.740，0.986)，敏感度為78.57%，特異度為83.33%，最佳截?cái)嘀禐?.345 μmol/L, 見圖1～2。

圖1 降解的巖藻糖診斷腹膜炎的ROC曲線 圖2 降解的甘露糖診斷革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎的ROC曲線

3 討 論

在全球范圍內(nèi)，腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生率估計(jì)為0.24～1.66次/患者年[1]。傳統(tǒng)的病原菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，耗時(shí)約為3～5 d，培養(yǎng)陽(yáng)性率與腹水中病原菌數(shù)量和種類密切相關(guān)，有些患者雖然有非常明確的細(xì)菌感染炎癥表現(xiàn)，腹膜透析液培養(yǎng)的病原學(xué)卻是陰性，影響了抗生素的選擇和治療。基于此，國(guó)內(nèi)外一直在不斷探索改進(jìn)檢測(cè)手段。目前有質(zhì)譜檢測(cè)、16s rRNA基因測(cè)序、納米材料檢測(cè)等均可以減少培養(yǎng)時(shí)間，有一定的敏感度和特異度，但成本高昂、不能提供藥敏信息、需要特殊檢測(cè)儀器等問題，限制了它們的應(yīng)用[10-13]。

本研究利用HPLC，通過酸降解和PCR后進(jìn)行色譜分析，檢測(cè)腹膜透析液中降解的單糖水平，發(fā)現(xiàn)腹膜透析相關(guān)性腹膜炎患者的透析液相較于無(wú)腹膜炎患者的透析液，降解的葡萄糖、巖藻糖含量是顯著降低的，甘露糖濃度在革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎感染中也是降低的。腹膜透析液中葡萄糖濃度的變化對(duì)腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的患者而言沒有意義，主要有以下原因：不同的患者腹膜功能不同，腹膜透析液的留腹時(shí)間、腹膜透析液的葡萄糖濃度不同和腹腔內(nèi)病原體生長(zhǎng)消耗都會(huì)影響葡萄糖的濃度。巖藻糖和甘露糖濃度的降低考慮與腹腔內(nèi)病原體生長(zhǎng)消耗、體內(nèi)炎癥狀態(tài)等有關(guān)。與革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎組相比，革蘭陰性菌腹膜炎組腹膜透析液中甘露糖的水平高，首要考慮是因?yàn)楦采w細(xì)菌表面的復(fù)雜聚糖網(wǎng)絡(luò)在革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌之間有所不同。其次，既往研究顯示，腹膜透析液中甘露糖濃度升高，對(duì)革蘭陰性菌感染引起的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，與機(jī)體自身的免疫反應(yīng)有關(guān)[14-15]。在臨床上，我們對(duì)遇到的3例培養(yǎng)陰性的腹膜炎患者進(jìn)行腹膜透析液的甘露糖濃度檢測(cè)，結(jié)果提示有2例患者的腹膜透析液甘露糖濃度小于0.345 μmol/L，提示存在革蘭陽(yáng)性菌感染，給予對(duì)革蘭陽(yáng)性菌敏感的頭孢唑林后治愈；1例患者的甘露糖濃度大于0.345 μmol/L，提示存在革蘭陰性菌感染，給予對(duì)革蘭陰性菌敏感的頭孢他啶后治愈，這進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的研究成果。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，腹膜透析相關(guān)性腹膜炎發(fā)生時(shí)，降解的巖藻糖水平明顯下降，對(duì)腹膜炎有明確的提示作用；檢測(cè)腹膜透析液的甘露糖濃度可以早期鑒別革蘭陽(yáng)性菌腹膜炎及革蘭陰性菌腹膜炎。HPLC相較于基因測(cè)序，檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低，對(duì)臨床上早期判斷病原菌種類，選用適當(dāng)抗生素有一定的指導(dǎo)意義。本研究為單中心研究，病例數(shù)較少，沒有納入真菌性腹膜炎患者，檢測(cè)單糖種類較少，還需要進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。