血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤患者外周血淋巴細胞亞群檢測的臨床意義

陸 洛，王 飛，顧偉英

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院，常州市第一人民醫(yī)院 血液科，江蘇 常州 213000)

血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤(AITL)是外周T細胞淋巴瘤(PTCL)的一種亞型，占PTCL的15%～20%[1]，其發(fā)病率具有明顯的地域差異。2012年我國一項多中心研究報道的AITL占PTCL 12.44%[2]，比例略低于國外報道(美國16%，亞洲18%，歐洲29%)[3]。盡管AITL發(fā)病率低，但卻進展快、侵襲性高、死亡率及復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。其腫瘤起源于生發(fā)中心濾泡輔助T細胞(TFH)，AITL 具有獨特的腫瘤微環(huán)境，表現(xiàn)為少數(shù)惡性 TFH 細胞與多種多譜系免疫細胞混合，是一類具有特殊病理形態(tài)、免疫表型及生物學行為的侵襲性淋巴瘤，并且與自身免疫異常有著密切的關(guān)系[4]，常表現(xiàn)為以免疫失調(diào)和免疫缺陷為特征的臨床綜合征，首發(fā)癥狀多表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫大，可伴隨出現(xiàn)B癥狀、肝脾大、骨髓浸潤，部分患者可出現(xiàn)皮疹、胸腔和腹腔積液、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎等。既往研究表明，患者免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的抗癌作用，其功能障礙促使疾病發(fā)生與進展[5]。在一些類型的淋巴瘤中，淋巴細胞減少可作為預(yù)后不良的標志。自體和同種異體干細胞移植后淋巴細胞的早期恢復(fù)是淋巴瘤控制和患者生存的重要預(yù)測指標[6]。但是關(guān)于AITL的研究較少，基于AITL的免疫特色，我們回顧性收集了蘇州大學附屬第三醫(yī)院收治的初診AITL患者的臨床資料，分析其臨床特征和影響預(yù)后的因素，并試圖探討患者診斷時外周血淋巴細胞免疫功能狀態(tài)、治療過程中的免疫反應(yīng)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對象 回顧性收集2016年3月至2021年9月就診于蘇州大學附屬第三醫(yī)院(常州市第一人民醫(yī)院)的16例初診AITL患者的資料，所有患者均在本院行病理學檢查，依據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴造血組織腫瘤分型標準確診，且在本院接受后續(xù)治療。并收集了10例健康人群的淋巴細胞亞群結(jié)果為對照組，其中男性7例，女性3例，中位年齡32歲(20～55歲)。本研究經(jīng)常州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(2022科第155號)，患者及對照組均知情同意并簽署知情同意書。

1.2治療方法 16例患者一線治療方案如下，接受CHOP方案化療(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)10例(62.50%)，接受CHOPE方案化療(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松、依托泊苷)3例(18.75%)，接受CHOP+西達苯胺方案化療2例(12.50%)，接受CHOP+西達苯胺+阿扎胞苷方案化療1例(6.25%)。

1.3資料收集及隨訪 收集患者基本資料及相關(guān)實驗室、影像學檢查結(jié)果，實驗室檢查如血常規(guī)、血清乳酸脫氫酶(LDH)、血清β2微球蛋白(β2-MG)、血清白蛋白、骨髓穿刺及活檢、免疫球蛋白及輕鏈、淋巴細胞亞群等指標。臨床分期依照Ann Arbor分期系統(tǒng)，體能狀態(tài)按東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分標準分為1～5 級，并采用國際預(yù)后指數(shù)(IPI)、外周T細胞淋巴瘤非特指型預(yù)后指數(shù)(PIT)、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤預(yù)后指數(shù)(PIAI)對本組患者進行評分[7]。通過門診或電話進行隨訪，隨訪截止時間為2022年4月30日。無進展生存時間(PFS)定義為從診斷時至第一次疾病進展死亡隨訪截止的時間?？偵鏁r間(OS)定義為從診斷時至任何原因?qū)е碌乃劳龌螂S訪截止的時間。

1.4外周血CD4/CD8比值臨界值設(shè)定 將CD4/CD8比值作為檢驗變量，以患者的OS狀態(tài)為狀態(tài)變量，定義事件為存活，繪制ROC曲線，計算臨界值。通過SPSS軟件計算得到曲線下面積(AUC)為0.906(95%CI0.762～1.000)，根據(jù)約登指數(shù)公式確定最佳臨界值為1.140。此時約登指數(shù)為0.630，敏感度為0.630，特異度為1.000。將CD4/CD8比值作為檢驗變量，以患者的PFS狀態(tài)為狀態(tài)變量，定義事件為進展，繪制ROC曲線，計算臨界值。通過SPSS軟件計算得到AUC為0.825(95%CI0.621～1.000)，根據(jù)約登指數(shù)公式確定最佳臨界值為1.140。此時約登指數(shù)為0.560，敏感度為0.560，特異度為1.000。最終選擇CD4/CD8臨界值為1.140，根據(jù)該值將病例分為高CD4/CD8組與低CD4/CD8組。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0進行統(tǒng)計學分析。采用Kaplan-Meier法及COX回歸模型進行生存分析，采用Log-Rank檢驗進行組間率的比較，計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗及Fisher精確概率，計量資料采用非參數(shù)檢驗。均進行雙尾檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1患者一般臨床特征 16例患者的中位年齡為71歲(53～83歲)，其中男性10例(62.50%)，女性6例(37.50%)。12例(75.00%)患者發(fā)病時有B癥狀。Ann Arbor分期為Ⅳ期者12例(75.00%)，Ⅲ期者3例(18.75%)，Ⅱ期者1例(6.25%)。9例患者(56.25%)合并有結(jié)外病變，其中合并鼻咽部受累者4例，皮膚受累3例，肺受累2例，腎臟受累1例，存在漿膜腔積液9例(56.25%)，骨髓受累2例(12.50%)。IPI評分3～5分者11例(68.75%)，PIT評分2～4分者12例(75.00%)，PIAI評分2～5分者14例(87.50%)。以CD4/CD8=1.140為臨界值，根據(jù)該值將病例分為高CD4/CD8組(5例)與低CD4/CD8組(11例)。兩組在年齡、實驗室檢查、分期、風險評分等基線特征方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示兩組基線匹配良好，指標之間有可比性，見表1。

表1 兩組基本臨床特征比較(例)

2.2初診AITL患者淋巴細胞亞群特征 和對照組相比，在外周血T細胞亞群中，患者初診時CD3+T細胞、CD4+T細胞計數(shù)及CD4/CD8比值明顯降低(P=0.007，P=0.003，P=0.031)，CD3+CD69+早期活化T細胞計數(shù)升高(P=0.014)，CD3+CD25+活化T細胞計數(shù)則明顯較低(P=0.006)。而B細胞亞群中，患者初診時CD19+B細胞、CD20+B細胞、CD5+CD19+及CD19+CD23+活化B細胞計數(shù)皆明顯低于正常對照(P<0.01，P<0.01，P=0.003，P=0.002)，盡管CD3-HLA-DR+B細胞計數(shù)較對照組高(P=0.003)，見圖1。

圖1 AITL患者診斷時與健康人群淋巴細胞亞群計數(shù)的比較 a、b分別為T細胞淋巴亞群及B細胞淋巴亞群

2.3治療后AITL患者淋巴細胞亞群的變化 動態(tài)監(jiān)測患者T細胞亞群，發(fā)現(xiàn)化療第1療程后，患者CD3+T細胞比例較診斷時明顯升高(P=0.040)，而3個療程后患者CD3+細胞比例回落，雖差異無統(tǒng)計學意義，但仍高于初診時。第1療程后CD4+T細胞比例、CD3+CD25+活化T細胞比例及CD4/CD8比值無明顯變化，而3個療程后，皆明顯高于初診時(P=0.017，P=0.045，P=0.017)。CD8+T細胞比例在第1療程后稍有升高，而3療程后明顯下降(P=0.015)，見圖2。

圖2 AITL患者治療前后淋巴細胞亞群的動態(tài)變化

2.4生存分析結(jié)果 單因素分析結(jié)果顯示ECOG評分高、PIT評分高、PIAI評分高、β2微球蛋白高、血清白蛋白低、Kappa鏈高、Lambda鏈高、CD4/CD8高與更差的PFS相關(guān)，而有漿膜腔積液、ECOG評分高、PIAI評分高、免疫球蛋白G(IgG)高、Lambda鏈高、CD4/CD8高與更差的OS相關(guān)(表2)。而納入多因素分析后，未見差異有統(tǒng)計學意義。16例患者中位隨訪時間474 d(20～1 760 d)，4例患者在療效評估前因疾病進展死亡，可評估的12例患者中，患者中期評估疾病進展(PD)1例，部分緩解(PR)9例，完全緩解(CR)2例。在隨后的治療中，死亡4例，終期可評估的患者8例，PD 1例，CR7例。中位PFS為194 d，中位OS為400 d。Kaplan-Meier分析顯示低CD4/CD8組PFS(未達到 vs 116 d，P=0.012)及OS(未達到 vs 116 d，P=0.002)均明顯優(yōu)于高CD4/CD8組，見圖3。患者的2年P(guān)FS率(63.60% vs 0)和2年OS率(72.70% vs 0)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 CD4/CD8比值對患者PFS及OS的影響

表2 影響AITL患者預(yù)后的單因素分析

3 討 論

AITL是PTCL中的第2種常見亞型，但僅占所有非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的1%～2%[3]。根據(jù)美國國家癌癥研究所監(jiān)測、流行病學和最終結(jié)果數(shù)據(jù)庫(SEER 數(shù)據(jù)庫)的大型人群研究報告數(shù)據(jù)，AITL診斷時的中位年齡為69歲，男性的發(fā)病率略高(51.50%)，80%的患者初診時即表現(xiàn)為晚期(Ⅲ～Ⅳ期)[8]。目前AITL 的一線治療方案仍以CHOP或CHOP樣方案為首選，盡管緩解率可以達到50%～70%，但其長期生存較差，5年OS率僅為30%～40%[9-11]。我們分析的16例患者基本特征與既往報道數(shù)據(jù)相似，中位年齡71歲，男性占62.50%，75.00%患者發(fā)病時有B癥狀，56.25%合并結(jié)外病變，93.75% Ann Arbor分期為Ⅲ期及Ⅳ期，且大部分患者預(yù)后評分為高危。一線予CHOP或CHOP樣方案化療后，客觀緩解率(ORR)43.75%，2年P(guān)FS率31.30%，2年OS率40.00%。因AITL發(fā)病率低，大樣本的病例報道及臨床研究均較為少見，至今仍缺乏明確公認的預(yù)后指標，本研究結(jié)果顯示ECOG評分高、PIT評分高、PIAI評分高、β2微球蛋白高、血清白蛋白低、Kappa鏈高、Lambda鏈高、CD4/CD8高的患者PFS更差，而有漿膜腔積液、ECOG評分高、PIAI評分高、IgG高、Lambda鏈高、CD4/CD8高的患者OS更差，與既往報道相符[9, 12]，但這些指標對AITL生存的評估價值還有待更多大樣本的臨床研究證實。

AITL是以嚴重炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)為特征的侵襲性淋巴瘤，腫瘤組織破壞淋巴組織的結(jié)構(gòu)和功能，而淋巴細胞的功能異常又導(dǎo)致機體免疫功能受損，免疫功能缺陷又進一步促進腫瘤的生長。因此通過分析患者淋巴細胞亞群，明確患者的免疫狀態(tài)，可為患者的臨床預(yù)后分析及免疫治療提供一定的思路。CD3為T細胞特有的標志，根據(jù)功能不同分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞(CD4+)，抑制/細胞毒 T淋巴細胞(CD8+)和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg細胞)。輔助T細胞通過分泌各種細胞因子、輔助誘導(dǎo)激活細胞毒T細胞發(fā)揮抗腫瘤作用；而細胞毒T細胞通過介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答控制腫瘤生長。B細胞主要參與體液免疫，產(chǎn)生抗原特異性抗體。NK細胞則發(fā)揮非特異性細胞毒性效應(yīng)。生理狀態(tài)下，各亞群之間的數(shù)量和功能處于平衡狀態(tài)，維持機體的免疫功能穩(wěn)定。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細胞的計數(shù)減低在彌漫大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤中為不良預(yù)后因素[13-15]，在多發(fā)性骨髓瘤中亦然[16]，而Treg細胞比例升高預(yù)示著彌漫大B細胞淋巴瘤預(yù)后不佳[17]。也有證據(jù)表明，NK 細胞在慢性粒細胞白血病、急性髓細胞白血病和骨髓增生異常綜合征中具有強大的抗腫瘤活性[18]。本研究中，AITL患者外周血中CD3+T細胞及CD4+T細胞計數(shù)、CD4/CD8比值較健康對照組明顯降低，CD8+T細胞計數(shù)與健康對照間差異無統(tǒng)計學意義，CD3+CD69+活化T細胞計數(shù)較對照組高，而CD3+CD25+活化T細胞計數(shù)明顯較低。CD3+、CD4+T細胞計數(shù)及CD4/CD8比例的降低，提示參與細胞免疫的淋巴細胞減少且比例異常，這可能導(dǎo)致機體特異性免疫應(yīng)答被削弱。CD69是T細胞活化后上調(diào)的最早標志物之一，它在靜止的淋巴細胞中以非常低的基礎(chǔ)水平表達，CD25是白介素-2(IL-2)受體的α鏈，在外周血調(diào)節(jié)性和靜息記憶T細胞表面呈組成性表達，可使得T淋巴細胞活化并進一步產(chǎn)生IL-2。可以推測，雖然AITL患者能啟動初始T細胞活化，但隨后進一步活化受限。另一方面，雖然CD3-HLA-DR+B細胞計數(shù)升高，但CD19+B細胞、CD20+B細胞、CD5+CD19+活化B細胞及CD19+CD23+活化B細胞計數(shù)皆明顯低于健康對照組。這些表明患者整體體液免疫功能也將受到抑制。最終將導(dǎo)致機體對惡性細胞免疫反應(yīng)減弱，從而降低機體清除惡性細胞的能力，使淋巴瘤細胞持續(xù)生長。但受限于回顧性研究，我們目前無法明確其可能的機制，有賴于后續(xù)研究進一步探索。既往有研究發(fā)現(xiàn)NK細胞及Treg細胞與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系[19-21]，但本研究中NK細胞、Treg細胞比例與健康對照組間差異無統(tǒng)計學意義，這可能與回顧性研究樣本量小有關(guān)。對治療過程中患者T細胞亞群的動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，化療第1療程后，CD3+T細胞比例較診斷時明顯升高，CD8+T細胞比例稍有升高，說明化療后外周血中成熟T淋巴細胞比例增加。3個療程后患者CD4+T細胞比例、CD3+CD25+活化T細胞比例及CD4/CD8比值皆明顯高于初診時，CD8+T細胞比例則明顯下降，這提示聯(lián)合化療可能使患者免疫功能部分恢復(fù)，尚需進一步開展研究，分層分析不同疾病狀態(tài)、不同治療反應(yīng)患者間免疫紊亂的程度，更深入地探索藥物對免疫功能的影響，為指導(dǎo)治療提供新思路。

鑒于單因素分析顯示CD4/CD8比值高與更差的PFS、OS相關(guān)，我們將患者分為高CD4/CD8組與低CD4/CD8組，生存分析顯示低CD4/CD8組PFS及OS均明顯優(yōu)于高CD4/CD8組。CD4+T細胞通過分泌各種細胞因子如IL-2以及輔助誘導(dǎo)激活CD8+T細胞發(fā)揮其抗腫瘤作用，CD8+T細胞在靶細胞上發(fā)揮細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)作用反過來又對CD4+細胞具有調(diào)節(jié)抑制作用。因此，推測對于高CD4/CD8比例的AITL患者，其免疫細胞以輔助T細胞為主，發(fā)揮ADCC作用的細胞毒T細胞可能較低CD4/CD8組不足，最終導(dǎo)致機體對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)低下，清除能力減弱。這提醒我們對于CD4/CD8比值高的患者是否應(yīng)采用更強烈的方案化療，或者加入新型治療藥物提高患者免疫應(yīng)答。沙利度胺具有抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)的作用，既往報道包含該藥物的GDPT方案(吉西他濱，順鉑，潑尼松和沙利度胺)可明顯改善PTCL患者的PFS 和OS[22]。另一項以免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺治療復(fù)發(fā)難治AITL的Ⅱ期多中心單臂臨床試驗，共入組26例，達到CR4例(15%)，ORR為31%[23]。由此看來，研究AITL的免疫功能可為進一步研究免疫調(diào)節(jié)藥物、細胞免疫治療提供一定的依據(jù)。

外周血淋巴細胞亞群作為較簡單易得的指標，對了解AITL患者免疫狀態(tài)、評估預(yù)后、指導(dǎo)治療有一定的意義。本研究資料為單中心回顧性研究，樣本量較小，無法對不同治療方案對AITL的預(yù)后影響進行詳細的分析討論，且隨訪時間短，可能造成統(tǒng)計結(jié)果的偏倚，進一步的結(jié)果仍需進行大樣本、前瞻性、多中心的臨床研究以提供循證醫(yī)學依據(jù)。