白楊素對(duì)離體培養(yǎng)致炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/PERK/CHOP通路的影響*

廖太陽(yáng)，楊 楠，張 力，吳 鵬，王培民，丁 亮

［南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（江蘇省中醫(yī)院）骨傷科，江蘇 南京 210029］

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型，在細(xì)胞外基質(zhì)的合成和更新過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并維持基質(zhì)的完整。研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡可引起軟骨破壞，使得關(guān)節(jié)功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的發(fā)生［1］。因此，維持軟骨細(xì)胞的正常功能對(duì)保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨健康具有重要意義。白楊素（chrysin，CHR）是一種具有多種藥理活性的黃酮類化合物，存在于許多植物中，如木蝴蝶和黃芩等，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用，同時(shí)對(duì)致炎軟骨細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用［2-4］。研究表明，CHR可通過(guò)抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB）活化及高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）信號(hào)通路緩解白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的人OA軟骨細(xì)胞凋亡并抑制炎癥，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌II型膠原，維持軟骨的正常功能［4-5］。另一項(xiàng)研究顯示，CHR可抑制糖尿病中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和氧化損傷［6］。然而，白楊素在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）中的軟骨保護(hù)機(jī)制，尤其是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/PERK/CHOP相關(guān)的信號(hào)通路，尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)以大鼠軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討CHR抑制軟骨細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制，為其治療骨關(guān)節(jié)炎提供部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，8周齡，體重160～180 g，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0002。于22～25℃，濕度55%～65%和晝夜更替時(shí)間12 h的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間大鼠正常自由攝水和飲食。

2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Corning；胎牛血清和Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Gibco；青霉素-鏈霉素溶液、ECL和胰酶購(gòu)自Biosharp；白楊素購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；脂多糖購(gòu)自Sigma；甲苯胺藍(lán)染色液購(gòu)自Leagene；蛋白酶和磷酸酶抑制劑和CCK-8購(gòu)自APExBIO；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Pharmingen；預(yù)制膠購(gòu)自南京艾思易生物科技有限公司；Hoechst 33342染色液、DAPI、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和RIPA強(qiáng)裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗Ⅱ型膠原抗體及羊抗兔和羊抗小鼠Ⅱ抗購(gòu)自Affinity；抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗cleaved caspase-3抗體、抗caspase-9抗體、抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）抗體、抗轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor-6，ATF-6）抗體、抗CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech；抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）抗體、抗p-PERK抗體、抗真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）抗體和抗p-eIF2α抗體購(gòu)自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

3 主要方法

3.1 大鼠原代軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)SD大鼠按照文獻(xiàn)中的方法［7-8］，取膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)軟骨，置于含1%雙抗的PBS溶液內(nèi)，漂洗2次后，用剪刀清理軟骨周圍的肌肉等組織，再將軟骨在PBS溶液中剪碎至1 mm×1 mm×1 mm碎塊，加入適量的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃下消化4 h，用70目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，濾過(guò)液經(jīng)300×g離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，接種至10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃恒溫、5%CO2體積分?jǐn)?shù)及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)24 h后換液，以后每2 d換液1次。鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞。

3.2 甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定大鼠軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠軟骨細(xì)胞以每孔4×104接種于12孔板，培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液。每孔滴加4%多聚甲醛500 μL，室溫固定30 min。每孔滴加甲苯胺藍(lán)染色液500 μL，室溫染色5 min，滴加等量無(wú)菌的蒸餾水輕輕混勻，染色15 min；PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔最后留1 mL PBS，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。Ⅱ型膠原免疫熒光染色：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞以每孔4×104接種于12孔板，培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液。每孔滴加4%多聚甲醛500 μL，室溫固定30 min。加入0.3%的Trition X-100透膜30 min，5%牛血清蛋白封閉1 h，Ⅱ型膠原抗體（1∶200）4℃孵育過(guò)夜。將羊抗兔Ⅱ抗（1∶1 000）避光孵育1 h，滴加適量DAPI孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將大鼠原代軟骨細(xì)胞接種至96孔板中（每孔1×104個(gè)），培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待軟骨細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照（control）組、LPS組和CHR處理

組（處理濃度分別為1和5 mg/L）。LPS的實(shí)驗(yàn)劑量和干預(yù)時(shí)間是參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及結(jié)合筆者所在實(shí)驗(yàn)室所培養(yǎng)細(xì)胞的具體情況進(jìn)行前期條件摸索所得［9-11］。對(duì)照組加入含0.1%二甲基亞砜的培養(yǎng)液，其余3組加入含1 mg/L的LPS培養(yǎng)液處理細(xì)胞12 h，后CHR處理組分別加入含1和5 mg/L的CHR培養(yǎng)液。藥物處理24 h后，各孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450 nm處吸光度（A）值。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。將大鼠軟骨細(xì)胞以每孔1×106接種于6孔板過(guò)夜培養(yǎng)，分組及給藥劑量參照方法3.3。藥物處理24 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，用不含EDTA的0.25%胰酶消化2 min、適當(dāng)吹打并收集各組細(xì)胞，300×g轉(zhuǎn)速下離心3 min，棄上清，加入500 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，分別加5 μL Annxeni V-FITC和5 μL PI染色試劑，輕輕混勻后暗室孵育20 min。最后用500 μL PBS補(bǔ)足1 mL，輕輕混勻，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

3.5 Hoechst 33342染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞核形態(tài)Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低，廣泛使用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞膜完整，熒光染料僅能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，此時(shí)正常細(xì)胞核呈現(xiàn)低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，熒光染料進(jìn)入凋亡細(xì)胞比正常細(xì)胞增多，此時(shí)凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)高強(qiáng)度藍(lán)色熒光。將大鼠軟骨細(xì)胞以每孔4×105接種于12孔板過(guò)夜培養(yǎng)，分組及給藥劑量參照方法3.3。藥物處理24 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入Hoechst 33342染色液600 μL，室溫避光染色15 min后，吸棄染色液，PBS洗滌細(xì)胞2 min，每孔加500 μL PBS。熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞核的形態(tài)變化并拍照，應(yīng)用ImageJ軟件定量分析藍(lán)色熒光強(qiáng)度。

3.6 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)將大鼠軟骨細(xì)胞以每孔1×106接種于6孔板培養(yǎng)，分組及給藥劑量參照方法3.3。藥物處理24 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞用混合液（VRIPA∶V蛋白酶和磷酸酶抑制劑=100∶1）4℃振蕩裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白并定量。取20 μg總蛋白在恒壓條件下完成SDS-PAGE，接著采用恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入Ⅰ抗（抗Bax抗體，1∶5 000；抗Bcl-2、抗cleaved caspase-3抗體和抗CHOP抗體，1∶2 000；抗GRP78抗體，1∶3 000；抗caspase-9抗體、抗ATF-6抗體、抗PERK抗體、抗p-PERK抗體、抗eIF2α抗體和 抗p-eIF2α抗 體，1∶1 000；抗GAPDH抗 體，1∶50 000）在4℃下孵育過(guò)夜。用TBST溶液洗滌10 min×3次，室溫孵育HRP標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000）2 h。用TBST溶液洗滌10 min×3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，對(duì)PVDF膜進(jìn)行逐條檢測(cè)，GAPDH作為內(nèi)參照，使用ImageJ軟件對(duì)獲取的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 7.04軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，組間比較使用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠原代軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)36 h后，染色結(jié)果均顯示大鼠軟骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形、多角形，呈現(xiàn)典型鋪路石狀。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)紫色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色。Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原的合成和分泌可作為軟骨細(xì)胞表型維持和鑒定的特征性指標(biāo)，光鏡下可見(jiàn)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Identification of primary rat chondrocytes by staining.A and B：toluidine blue staining；C and D：collagen type II immunofluorescence staining.Scale bar=100 μm in A and C；scale bar=50 μm in B and D.圖1原代大鼠軟骨細(xì)胞的染色鑒定

2 白楊素對(duì)致炎大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組軟骨細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與LPS組相比，1 mg/L和5 mg/L CHR干預(yù)均可以增加LPS致炎軟骨細(xì)胞的活力（P＜0.05），且5 mg/L CHR組效果更優(yōu)（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2.Chrysin（CHR）increased the viability of LPS-induced rat chondrocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖2 CHR增強(qiáng)LPS致炎大鼠軟骨細(xì)胞的活力

3 白楊素對(duì)致炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，LPS組凋亡率顯著增加（P＜0.05）；相較于LPS組，1 mg/L和5 mg/L CHR組凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；與1 mg/L CHR組比較，5 mg/L CHR組凋亡率進(jìn)一步顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

4 白楊素對(duì)凋亡大鼠軟骨細(xì)胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，各組染色標(biāo)記軟骨細(xì)胞核均染成藍(lán)色，但LPS組細(xì)胞核呈高亮度熒光，熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，1 mg/L和5 mg/L CHR組細(xì)胞核熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05）；與1 mg/L CHR組比較，5 mg/L CHR組細(xì)胞核熒光強(qiáng)度進(jìn)一步顯著減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 3.Chrysin（CHR）inhibited LPS-induced apoptosis of rat chondrocytes.The apoptosis was analyzed using Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖3 CHR抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡

5 白楊素對(duì)致炎大鼠軟骨細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS組Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值顯著下降（P＜0.05）；與LPS組 比 較，1 mg/L和5 mg/L CHR組Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05）；與1 mg/L CHR組比較，5 mg/L CHR組Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 4.Chrysin（CHR）improved the nuclear morphology of apoptotic rat chondrocytes.Hoechst 33342 staining was used to observe the nuclear changes of apoptotic cells（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖4 CHR改善凋亡大鼠軟骨細(xì)胞核形態(tài)

6 白楊素對(duì)致炎大鼠軟骨細(xì)胞GRP78/PERK/CHOP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS組GRP78、ATF-6、CHOP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，1 mg/L和5 mg/L CHR組GRP78、ATF-6、CHOP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），且以5 mg/L CHR組效果更顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

討 論

黃酮類化合物是治療骨關(guān)節(jié)炎的主要有效成分［12］。本研究探討了黃酮類化合物CHR對(duì)致炎軟骨細(xì)胞抗凋亡的作用及機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先使用1 mg/L脂多糖誘發(fā)大鼠軟骨細(xì)胞炎癥和凋亡，成功建立OA體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，值得強(qiáng)調(diào)的是，LPS可刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，目前已被廣泛用于OA軟骨細(xì)胞模型［9-11］，故本研究采用該模型開(kāi)展了系列實(shí)驗(yàn)，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CHR可提高OA軟骨細(xì)胞活力，Hoechst 33342染色法、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白則顯示了CHR對(duì)致炎軟骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。近年來(lái)的研究也表明，CHR可通過(guò)NF-κB及HMGB1信號(hào)通路，提高軟骨細(xì)胞活力，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡［4-5］。在過(guò)氧化氫刺激H9c2心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，也證實(shí)CHR能通過(guò)上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）基因表達(dá)和減少細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生來(lái)抑制細(xì)胞凋亡［13］，這說(shuō)明CHR具有良好的抗細(xì)胞凋亡潛力。此外，本課題組也從分子生物學(xué)層面表明CHR通過(guò)激活GRP78/PERK/CHOP信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡的作用。

OA作為一種關(guān)節(jié)炎癥性疾病，軟骨細(xì)胞凋亡在炎癥引起的病理生理變化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，軟骨細(xì)胞凋亡更是伴隨著OA的整個(gè)病程。OA發(fā)病過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增強(qiáng)加速軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡，軟骨逐漸失去正常的生物學(xué)功能，導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍形成和缺失［14］。為控制軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡，維持膝關(guān)節(jié)內(nèi)部ECM平衡，軟骨細(xì)胞Bcl-2選擇性表達(dá)增強(qiáng)，以達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命及延緩OA發(fā)病過(guò)程的目的［15］。Bax功能則與Bcl-2作用相反，能夠通過(guò)增強(qiáng)線粒體膜通透性的方式促進(jìn)凋亡，其表達(dá)水平的升高更是原發(fā)性O(shè)A的重要原因［16-17］?？沟蛲鯞cl-2/促凋亡Bax之間的失衡直接引發(fā)caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活caspase-3和caspase-9等凋亡分子，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［18-19］。為進(jìn)一步探究白楊素抑制軟骨細(xì)胞凋亡的可能生物調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值，結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的OA細(xì)胞模型中觀察到軟骨細(xì)胞凋亡增多，而CHR干預(yù)可升高Bcl-2/Bax比值，并降低cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平，抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，提示CHR可通過(guò)改善抗凋亡與促凋亡蛋白的失衡以緩解軟骨細(xì)胞凋亡。

Figure 5.Chrysin（CHR）ameliorated the imbalance between anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins to alleviate rat chondrocyte apoptosis.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖5 CHR改善抗凋亡與促凋亡蛋白的失衡緩解大鼠軟骨細(xì)胞凋亡

軟骨細(xì)胞凋亡涉及的調(diào)控因子及通路眾多，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/PERK/CHOP就是其中一條重要的信號(hào)通路，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及干預(yù)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號(hào)以減少軟骨細(xì)胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎治療的有效作用靶點(diǎn)［20］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)下的UPR反應(yīng)通常涉及三種感受器蛋白：ATF-6、PERK和IRE1α［21］。三種感受器在生理?xiàng)l件下與分子伴侶結(jié)合免疫球蛋白（glucose regulated protein 78/binding-immunoglobulin protein，GRP78/Bip）結(jié)合而保持非活性狀態(tài)。當(dāng)感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78被激活分離，PERK先一步發(fā)生磷酸化，并催化eIF2-α磷酸化，CHOP表達(dá)增加，引起B(yǎng)cl-2和caspase家族之間失衡，激活GRP78/PERK/CHOP等一系列凋亡信號(hào)及相關(guān)的下游反應(yīng)，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡［22-23］。本研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的OA細(xì)胞模型中觀察到GRP78等ERS相關(guān)因子表達(dá)增強(qiáng)，而白楊素處理后，軟骨細(xì)胞中GRP78、ATF-6、CHOP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α表達(dá)顯著降低，提示白楊素可能是通過(guò)抑制GRP78/PERK/CHOP信號(hào)通路活化，以抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本離體實(shí)驗(yàn)研究初步證實(shí)白楊素可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，GRP78/PERK/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是介導(dǎo)該作用的可能分子機(jī)制之一，這使其可成為治療骨關(guān)節(jié)炎新的靶點(diǎn)，并從細(xì)胞水平為臨床骨關(guān)節(jié)炎的藥物治療提供了參考資料。

Figure 6.Chrysin（CHR）inhibited the activation of GRP78/PERK/CHOP signaling pathway in rat chondrocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖6 CHR抑制大鼠軟骨細(xì)胞GRP78/PERK/CHOP信號(hào)通路活化