miR-409-3p通過抑制PIK3CA介導的自噬增強耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性*

廖鳳兒，陶 瑩，駱 婕，李 筠，郭 琴

（廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510062）

卵巢癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤［1］。手術切除及術后輔以紫杉醇或鉑類藥物為主的化療是標準的卵巢癌治療方法［2］?；熌退幮詴萍s化療效果，并且這種耐藥性往往也存在交叉性耐藥，此時更換或聯(lián)合其他種類化療藥物也難以使病人獲益［3-4］。因此，尋找能使得卵巢癌耐藥細胞重新恢復化療敏感性的方法具有重要意義。

既往研究報道，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及化療耐藥等生物學行為的調控中發(fā)揮著關鍵作用［5-6］。miR-409-3p已被發(fā)現(xiàn)可抑制胃癌、肝癌和乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生和進展［7-9］。另外，miR-409-3p可通過靶向beclin-1逆轉結直腸癌細胞的奧沙利鉑耐藥性［10］。然而，miR-409-3p在卵巢癌中對順鉑敏感性的影響仍不清楚。因此，本研究探討miR-409-3p對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響，并分析可能的機制。

材料和方法

1 材料

卵巢癌細胞株SKOV3和A2780（武漢普諾賽生命科技有限公司）；耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP和A2780/DDP（上海信裕生物技術有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素/鏈霉素和DMEM培養(yǎng)液（Thermo Fisher Scientific）；順鉑（純度99.95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；雷帕霉素（rapamycin，Rap；純度＞99%，Selleck）；WST-1比色法細胞活力定量試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；Cyto-ID細胞自噬檢測試劑盒（Enzo Life Sciences）；Hiperfect轉染試劑、RNeasy試劑盒、Omniscript RT試劑盒和Taq PCR Master Mix試劑盒（Qiagen）；野生型（wild-type，WT）和突變型（mutant，MUT）磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）3′UTR螢光素酶表達載體、miR-NC及miR-409-3p mimics由上海生工生物工程有限公司構建；si-NC、si-PIK3CA、pcDNA-NC、pcDNA-PIK3CA、攜帶miR-NC的慢病毒（lentivirus，LV）載 體（LV-miR-NC）、LV-miR-409-3p mimics和LVPIK3CA由廣州銳博生物科技有限公司構建；beclin-1和SQSTM1抗體（Cell Signaling Technology）；LC3和PIK3CA抗體（Arigo Biolaboratories）；GAPDH抗體和HRP標記的羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術有限公司）。

2 方法

2.1 臨床樣本收集選取接收腫瘤切除術且在術后給予以鉑類藥物為主的標準流程化療方案的II～III期卵巢癌患者。收集受試者的切除癌組織與癌旁組織（約距癌浸潤邊緣2 cm，并經(jīng)病理驗證為非腫瘤組織）。其中，在化療后6個月內(nèi)復發(fā)的受試者的癌組織定義為化療耐藥組織，6個月未復發(fā)的受試者的癌組織定義為化療敏感組織。本研究共納入16例化療敏感癌組織和10例化療耐藥癌組織，同時納入對應的癌旁非腫瘤組織。將組織樣品快速冷凍并儲存在-80℃，備用。本研究通過廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，采集樣本的受試者均簽署書面知情同意。

2.2 細胞培養(yǎng)SKOV3和A2780細胞種植在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞種植在含有20 mg/L順鉑、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

2.3 RT-qPCR檢測miR-409-3p表達使用RNeasy試劑盒從組織和細胞中提取總RNA。利用Omniscript RT試劑盒逆轉錄為cDNA。然后根據(jù)Taq PCR Master Mix試劑盒說明書步驟，以cDNA為模板進行RT-qPCR分析。miR-409-3p的上游引物序列為5′-GCGAATGTTGCTCGGTGA-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參照U6的上游引物序列為5′-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-qPCR循環(huán)條件為：95℃20 s，然后40個循環(huán)（95℃15 s，58℃1 min）。采用2-ΔΔCt法分析miR-409-3p相對表達量。

2.4 靶基因預測與驗證用starBase在線數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）預測PIK3CA為miR-409-3p的潛在靶基因之一。根據(jù)預測結合的序列構建WT和MUT PIK3CA 3′UTR螢光素酶表達載體，然后根據(jù)雙螢光素酶報告基因試劑盒指示步驟，將其分別與miR-409-3p mimic和miR-NC轉入細胞，轉染48 h后，用PBS洗2次，加入底物，用發(fā)光儀測定發(fā)光強度，并計算相對螢光素酶活性。

2.5 細胞轉染與藥物處理分別取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞，按照說明書指示步驟，用Hiperfect轉染試劑分別將miR-NC或miR-409-3p mimics、si-NC或si-PIK3CA、pcDNA-NC或pcDNAPIK3CA轉入細胞，培養(yǎng)48 h。用（或不用）終濃度100 nmol/L的Rap處理上 述 細胞30 min后，收集 細胞，用于后續(xù)實驗。

2.6 細胞活力檢測細胞均以10000細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，并分別給予2.5、5、10、20、40和80 mg/L的順鉑中培養(yǎng)2 d。參照WST-1比色法定量試劑盒說明書步驟，采用酶標儀在450 nm處的吸光度值。

2.7 細胞凋亡檢測細胞均以3.5×105個細胞/孔的密度接種于6個孔板上，并給予20 mg/L順鉑培養(yǎng)2 d。按照說明書指示步驟，在避光條件下，用Annexin V-FITC和PI試劑孵育細胞15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.8 Cyto-ID染色取處理后的細胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中并待細胞貼壁后，按照說明書指示步驟，用Cyto-ID綠色染料標記自噬小泡，然后用Hoechst 33342標記細胞核，用激光共聚焦顯微鏡觀察并獲取Cyto-ID陽性斑點圖像，并用Adobe Photoshop CC軟件計數(shù)每個細胞中Cyto-ID陽性斑點數(shù)，每個視野至少計數(shù)20個細胞。

2.9 Western blot取人組織和細胞樣品，在4℃下用RIPA裂解萃取蛋白質。蛋白質定量后，用快速蛋白免疫轉印系統(tǒng)進行轉印。將其轉印于PVDF膜的蛋白用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按抗體說明書的稀釋比例，分別孵育beclin-1、SQSTM1、LC3、PIK3CA和GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗5 min×3次，孵育HRP-羊抗兔IgG二抗，室溫1 h。通過增強的化學發(fā)光試劑顯影。以GAPDH為內(nèi)部參照，利用Image J軟件分析蛋白相對表達量。

2.10 裸鼠荷瘤實驗此實驗由威斯騰生物醫(yī)藥科技有限公司完成。分別將穩(wěn)轉LV-miR-NC、LV-miR-409-3p mimics及LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA（共轉染）的SKOV3/DDP細胞用PBS制備成1×1010L-1的細胞懸液，取150 μL接種至BALB/c裸鼠右腋皮下。小鼠分別給予或未給予腹腔注射順鉑（5 mg/kg，每周3次，持續(xù)4周）和/或Rap（2 mg/kg，每天1次，持續(xù)4周），每周用游標卡尺測量瘤體長徑和短徑，并計算瘤體體積（瘤體體積=長徑×短徑2/2）。第4周末，麻醉小鼠，收集瘤體，按照常規(guī)法將瘤體組織用石蠟包埋，并切片（4 μm）。切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復與封閉后，按照免疫組化SABC法進行操作，顯微鏡下觀察瘤體組織中beclin-1和PIK3CA的表達情況。

3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（mean±SD）描述。兩組間差異比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩事后比較用Bonferroni校正法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 耐藥卵巢癌組織和細胞中miR-409-3p表達下調

與癌旁組織比較，化療敏感和耐藥卵巢癌組織中miR-409-3p表達水平均顯著降低（P＜0.05），且耐藥卵巢癌組織中miR-409-3p表達水平較敏感組織顯著降低（P＜0.05），見圖1A。在卵巢癌細胞系中，耐順鉑細胞系SKOV3/DDP和A2780/DDP中miR-409-3p表達水平均顯著低于其親本細胞（P＜0.05），見圖1B。

Figure 1.Expression of miR-409-3p in ovarian cancer tissues and cells.A：miR-409-3p expression levels in chemosensitive tumor（T）tissues（n=16），chemo-resistant T tissues（n=10）and their corresponding adjacent non-tumor（N）tissues；B：miR-409-3p expression levels in SKOV3，SKOV3/DDP，A2780 and A2780/DDP cells（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05 vs N；#P＜0.05 vs sensitive；△P＜0.05 vs SKOV3 cells；▲P＜0.05 vs A2780 cells.圖1卵巢癌組織和細胞中miR-409-3p表達情況

2 miR-409-3p提高耐藥卵巢癌細胞的順鉑敏感性

與miR-NC組比較，miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞的活力（圖2A、B）均顯著降低（P＜0.05），凋亡比例（圖2C）均顯著升高（P＜0.05）。

3 miR-409-3p抑制自噬

Figure 2.Over-expression of miR-409-3p reduced cisplatin resistance.A and B：the viability of A2780/DDP（A）and SKOV3/DDP（B）cells was detected by WST-1 assay；C：the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-NC group.圖2過表達miR-409-3p降低順鉑耐藥性

Cyto-ID染色結果（圖3A）顯示，與miR-NC組比較，miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中平均每個細胞的Cyto-ID染色斑點數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。Western blot檢測自噬相關蛋白結果（圖3B）顯示，與miR-NC組比較，miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細 胞 中beclin-1表達水平和LC3-II/LC3-I比值均顯著降低（P＜0.05），SQSTM1表達水平均顯著升高（P＜0.05）。

4 自噬誘導劑Rap能消除miR-409-3p的順鉑增敏作用

WST-1實驗（圖4A、B）和流式細胞術（圖4C）結果顯示，與miR-409-3p mimics組比較，miR-409-3p mimics+Rap組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞活力均顯著升高（P＜0.05），凋亡率均顯著降低（P＜0.05）。

5 miR-409-3p靶向抑制PIK3CA表達

生物信息學預測PIK3CA與miR-409-3p存在潛在結合序列（圖5A）。雙螢光素酶報告基因結果（圖5B）顯示，在轉染W(wǎng)T PIK3CA 3′UTR螢光素酶表達載體的細胞，與miR-NC組比較，miR-409-3p mimics組相對螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而在轉染MUT PIK3CA 3′UTR螢光素酶表達載體的細胞，miRNC組的相對螢光素酶活性與miR-409-3p mimics組無顯著差異（P＞0.05）。Western blot結果顯示，與化療敏感組織或敏感細胞比較，耐藥組織（圖5C）和耐順鉑細胞（圖5D）中PIK3CA蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC組比較，miR-409-3p mimics組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中PIK3CA蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），見圖5E。

6 敲減PIK3CA能抑制卵巢癌細胞自噬并增強其對順鉑的敏感性

Cyto-ID染色結果（圖6A）顯示，與si-NC組比較，si-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中平均每個細胞的Cyto-ID染色斑點數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。Western blot檢測自噬相關蛋白結果（圖6B）顯示，與si-NC組比較，si-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中beclin-1表達水平和LC3-II/LC3-I比值均顯著降低（P＜0.05），SQSTM1表達水平均顯著升高（P＜0.05）。WST-1（圖7A、B）和流式細胞術（圖7C）結果顯示，與si-NC組比較，si-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞活力均顯著降低（P＜0.05），凋亡比例均顯著升高（P＜0.05）。

Figure 3.Over-expression of miR-409-3p reduced autophagy of drug-resistant ovrian cancer cells.A：Cyto-ID staining of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells（scale bar=10 μm）；B：the expression levels of autophagy-related proteins beclin-1，LC3 and SQSTM1 in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-NC group.圖3過表達miR-409-3p降低耐藥卵巢癌細胞自噬水平

Figure 4.Rapamycin（Rap）eliminated the sensitizing effect of miR-409-3p on drug-resistant ovrian cancer cells to cisplatin.A and B：the viability of A2780/DDP（A）and SKOV3/DDP（B）cells was detected by WST-1 assay；C：the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-409-3p mimics group.圖4雷帕霉素消除miR-409-3p對耐藥卵巢癌細胞的順鉑增敏作用

Figure 5.PIK3CA was the target gene of miR-409-3p.A：predicted PIK3CA binding sequence to miR-409-3p；B：luciferase activity detection to validate the binding relationship（n=3）；C：the expression levels of PIK3CA in chemosensitive tumor（T）tissues（n=16），chemoresistant T tissues（n=10）and their corresponding adjacent non-tumor（N）tissues；D：the expression levels of PIK3CA in SKOV3，SKOV3/DDP，A2780 and A2780/DDP cells（n=3）；E：the expression levels of PIK3CA in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells from miR-NC and miR-409-3p mimics groups（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs N；&P＜0.05 vs sensitive；△P＜0.05 vs A2780 cells；▲P＜0.05 vs SKOV3 cells.圖5 PIK3CA為miR-409-3p的靶基因

7 過表達PIK3CA能消除miR-409-3p的抑制自噬和順鉑增敏的作用

Western blot結果（圖8A）顯示，與miR-409-3p mimics+pcDNA-NC組 比 較，miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中PIK3CA和beclin-1表達水平及LC3-II/LC3-I比值均顯著升高（P＜0.05），SQSTM1表達水平均顯著降低（P＜0.05）。Cyto-ID染色結果（圖8B）顯示，與miR-409-3p mimics+pcDNA-NC組 比較，miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞中平均每個細胞的Cyto-ID染色斑點數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。WST-1（圖9A、B）和流式細胞術（圖9C）結果顯示，與miR-409-3p mimics+pcDNA-NC組比較，miR-409-3p mimics+pcDNA-PIK3CA組SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞活力均顯著升高（P＜0.05），凋亡率均顯著降低（P＜0.05）。

8 miR-409-3p、PIK3CA和順鉑對SKOV3/DDP細胞移植瘤小鼠荷瘤生長的影響

游標卡尺測量的瘤體體積結果（圖10A）顯示，與對照組比較，LV-miR-409-3p mimics組和單獨順鉑組的瘤體體積均顯著減小（P＜0.05）；與單獨順鉑組比較，順鉑+LV-miR-409-3p mimics組的瘤體體積顯著減小（P＜0.05）；與順鉑+LV-miR-409-3p mimics組比較，順鉑+LV-miR-409-3p mimics+Rap組和順鉑+LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA組的瘤體體積均顯著增大（P＜0.05）。第4周分離的瘤體的照片也顯示出與游標卡尺測量的瘤體體積相似的結果，順鉑+LV-miR-409-3p mimics組瘤體顯示的體積最小（圖10B）。免疫組織化學染色結果（圖10C）顯示，順鉑+LV-miR-409-3p mimics+Rap組和順鉑+LV-miR-409-3p mimics+PIK3CA組瘤體組織中PIK3CA和beclin-1陽性染色范圍廣且染色強度高，但LV-miR-409-3p mimics組和順鉑+LV-miR-409-3p mimics組瘤體組織中PIK3CA和beclin-1陽性染色范圍?。ㄉ踔敛糠忠曇拔匆婈栃匀旧┣胰旧珡姸鹊汀?/p>

Figure 6.Knockdown of PIK3CA reduced autophagy level.A：Cyto-ID staining of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells（scale bar=10 μm）；B：the expression levels of autophagy-related proteins beclin-1，LC3 and SQSTM1 in A2780/DDP and SKOV3/DDP cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.圖6敲減PIK3CA降低細胞自噬水平

Figure 7.Knockdown of PIK3CA enhanced cisplatin sensitivity.A and B：the viability of A2780/DDP（A）and SKOV3/DDP（B）cells was detected by WST-1 assay；C：the apoptosis of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.圖7敲減PIK3CA增強順鉑敏感性

Figure 10.miR-409-3p increased the sensitivity of SKOV3/DDP cells to cisplatin in vivo.A：changes of the tumor volume in each group；B：photographs of the isolated tumors in each group；C：representative immunohistochemical staining images of PIK3CA and beclin-1 in isolated tumor tissues of each group.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs cisplatin group；&P＜0.05 vs cisplatin+LV-miR-409-3p mimics group.圖10 miR-409-3p增加SKOV3/DDP細胞在體內(nèi)對順鉑的敏感性

討 論

在腫瘤的研究中，許多影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展和化療藥物敏感性的癌基因和抑癌基因都受到miRNAs的調控，故這些miRNAs可能成為新的治療靶點［5-6，11］。miR-409-3p已被報道在多種腫瘤中可作為腫瘤抑制因子［7-9］。近來研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-409-3p可部分恢復結直腸癌耐藥細胞對順鉑的敏感性［10］。盡管miR-409-3p已被證明在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有調控功能，但其在卵巢癌中對順鉑化療的具體作用尚不清楚。本研究結果顯示，miR-409-3p能增強卵巢癌耐藥細胞對順鉑的敏感性。

自噬參與調控腫瘤的化療的敏感性。一些研究顯示，自噬能在腫瘤細胞化療中對化療劑誘導的凋亡起著協(xié)同作用［12-13］。但更多的研究支持自噬在腫瘤細胞（特別是在實體腫瘤細胞）中主要表現(xiàn)為對化療劑導致的凋亡起拮抗作用，起到降低化療敏感性的效應［14-16］。推測造成這種現(xiàn)象的差異可能是因為不同種類的細胞的自噬閾值以及的應激條件的不同。另外，順鉑在殺傷卵巢癌A2780細胞的同時也能引起自噬，繼而發(fā)生耐藥［17］。本研究探索了miR-409-3p對自噬的影響。其中，beclin-l參與了從自噬體的形成到自噬溶酶體的成熟的途徑中的每一個重要步驟，是自噬激活的關鍵分子［18］；自噬小體中的LC3-II是細胞發(fā)生自噬的分子標志，LC3-II/LC3-I比值可反映自噬的水平［19］；SQSTM1與泛素化蛋白結合，再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的LC3-II蛋白形成復合物，在自噬溶酶體內(nèi)降解，進而促進自噬［18-19］。本研究顯示，在耐藥卵巢癌組織和細胞中beclin-1表達水平和LC3-II/LC3-I比值升高，而SQSTM1表達水平降低，提示自噬活性增強；外源性過表達miR-409-3p能抑制耐藥卵巢癌細胞的自噬，而激活自噬能消除miR-409-3p的功能，提示miR-409-3p能通過抑制自噬進而恢復耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

miRNAs可通過轉錄后水平負向調控靶基因的表達來廣泛參與細胞的生長、增殖、分化和凋亡等生理病理過程［5-6］。本研究借助生物信息學分析顯示miR-409-3p與PIK3CA存在靶向結合序列，進一步研究得出PIK3CA是miR-409-3p的直接調控靶點。PIK3CA可通過AKT/mTOR信號激活自噬［20-21］。本研究顯示，敲減PIK3CA能抑制耐藥卵巢癌細胞自噬，而過表達PIK3CA能消除miR-409-3p抑制自噬和順鉑增敏的作用，說明miR-409-3p可通過靶向PIK3CA而抑制促存活自噬，進而恢復耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，miR-409-3p可通過抑制PIK3CA介導的自噬在耐藥卵巢癌細胞中發(fā)揮順鉑增敏作用。