組蛋白脫乙酰酶激動(dòng)劑ITSA-1通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活減輕心肺復(fù)蘇后大鼠腦損傷*

張晨禹，詹浩洪，魏紅艷，周大旺，張 強(qiáng)，黎 博，胡春林△

（1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510080；4中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院急診與災(zāi)難醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 510107）

心臟停搏（cardiac arrest，CA）是指心臟機(jī)械活動(dòng)停止，循環(huán)體征消失，是患者死亡的主要原因之一，每年造成死亡人數(shù)超55萬(wàn)人［1］。當(dāng)患者自主循環(huán)恢復(fù)（restoration of spontaneous circulation，ROSC）后大多會(huì)發(fā)生心臟停搏后綜合征（post-cardiac arrest syndrome，PCAS），主要包括腦損傷、心功能障礙、全身缺血/再灌注損傷以及致病誘因持續(xù)存在的病理生理過(guò)程［2］。膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞類(lèi)型之一，在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，膠質(zhì)細(xì)胞激活扮演著重要角色，如星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子釋放，小膠質(zhì)細(xì)胞極化后加重了局部的炎癥損傷。膠質(zhì)細(xì)胞激活后會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激并凋亡。因此，抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活可能對(duì)CA后腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

組蛋白乙酰化修飾在心臟疾病的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮重要作用［3］。研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞激活伴隨組蛋白的高乙?；M蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HADC）通過(guò)下調(diào)Toll樣受體活性、減少核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide

因此，本研究旨在探討組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶激動(dòng)劑ITSA-1是否能夠有效抑制大鼠CA后腦膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，減輕大鼠心肺復(fù)蘇后炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元損傷，為防治復(fù)蘇后腦損傷提供參考。

材料和方法

1 動(dòng)物

30只SPF級(jí)4月齡Wistar雄性大鼠，體重約370～420 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK（粵）2019-0209。所有大鼠均可自由進(jìn)食飲水，安靜環(huán)境飼養(yǎng)且12 h光照晝夜交替，環(huán)境溫度25℃，濕度50%定期更換飼料。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)（SYSU-IACUC-2021-000081），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

2 主要試劑和儀器

ITSA-1（HY-100508）購(gòu) 自MedChemExpress；抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體（60190）和抗離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）單克隆抗體（26177）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；抗pan-acetylation抗體（66289）購(gòu)自Proteintech；抗caspase-3抗體（9662S）、抗Bcl-2抗體（2762）、抗Bax抗體（2772）、抗cleaved caspase-3抗體（9661S）和抗GAPDH抗體（5174）購(gòu)自上海賽信通生物試劑有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（JER-06）和大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（JER-01）購(gòu)自安徽巧伊生物科技有限公司；蘇木精-伊 紅（hematoxylin-eosin，HE）染 色 試 劑 盒（BPDL001）和Nissl染色試劑盒（BP-DL301）購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)（R415）購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；多參數(shù)便攜式心電監(jiān)護(hù)儀（GS20）購(gòu)自深圳飛利浦金科威實(shí)業(yè)有限公司。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥模型制備具體見(jiàn)參考文獻(xiàn)［6-8］。大鼠禁食過(guò)夜后，通過(guò)腹膜注射3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進(jìn)行麻醉。氣管插入14G導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。分離雙側(cè)股動(dòng)靜脈，使用留置針穿刺右測(cè)股動(dòng)脈監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，左測(cè)股靜脈注射給藥。連接心電監(jiān)護(hù)儀連續(xù)記錄血壓、心率、呼吸頻率等參數(shù)。通過(guò)靜脈注射維庫(kù)溴銨（0.1 mg/kg）以阻斷呼吸，同時(shí)封閉氣管插管。由于缺氧，動(dòng)物的血壓逐漸下降。當(dāng)平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）低于30 mmHg時(shí)，定義為CA。本實(shí)驗(yàn)CA持續(xù)時(shí)間為12 min，待大鼠CA持續(xù)時(shí)間到達(dá)后，恢復(fù)機(jī)械通氣（潮氣量8 mL/kg，呼吸頻率60 min-1），靜脈注射腎上腺素（每3 min注射20 μg/kg）和碳酸氫鈉（1.0 mL/kg），并使用按壓裝置進(jìn)行胸外按壓，具體標(biāo)準(zhǔn)為200 min-1的頻率及胸廓前后徑1/3的深度。當(dāng)發(fā)生室上性節(jié)律且MAP高于60 mmHg持續(xù)15 min以上時(shí)視為ROSC。若基礎(chǔ)生命支持（basic life support，BLS）持續(xù)10 min后仍未達(dá)到ROSC則定義為失敗。本實(shí)驗(yàn)30只大鼠共分為假手術(shù)（sham）組、模型（model）組和ITSA-1處理組（ITSA組），每組各10只。其中sham組10只大鼠在注射維庫(kù)溴銨的同時(shí)進(jìn)行機(jī)械通氣，而model組和ITSA組大鼠CA 12 min后進(jìn)行心肺復(fù)蘇，建立CA模型。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠ROSC 3 h后肌松藥物已失效，此時(shí)撤去呼吸機(jī)，改為自主呼吸。

3.2 生存研究及生理參數(shù)記錄心電監(jiān)護(hù)儀持續(xù)記錄大鼠血壓并繪制折線圖。記錄所有大鼠ROSC后72 h內(nèi)的生存狀態(tài)，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。

3.3 神經(jīng)功能評(píng)估各組動(dòng)物在術(shù)后清醒自主活動(dòng)情況下，參照神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological deficit score，NDS）量表評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況［9］，評(píng)分主要包括清醒、腦干功能、運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估、感覺(jué)功能評(píng)估、運(yùn)動(dòng)行為、行為和癲癇發(fā)作7個(gè)方面。評(píng)測(cè)由獨(dú)立研究人員分別在ROSC后24、48和72 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)評(píng)估神經(jīng)功能。不同時(shí)點(diǎn)的總分作為獨(dú)立評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中0分對(duì)應(yīng)腦死亡，80分對(duì)應(yīng)神經(jīng)功能正常，以72 h的總體NDS評(píng)分作為神經(jīng)功能結(jié)局的主要終點(diǎn)。

3.4 海馬組織切片HE染色和Nissl染色在ROSC后72 h，深度麻醉處死大鼠，開(kāi)顱收集大腦。使用4%多聚甲醛灌注固定、脫水并包埋在石蠟中。然后使用標(biāo)準(zhǔn)HE和Nissl染色試劑盒進(jìn)行染色，使用二甲苯將切片透明化，干燥切片，最后使用中性樹(shù)膠封片。所有切片統(tǒng)一在20倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，并隨機(jī)選取5個(gè)海馬CA1區(qū)的視野，觀察比較切片中細(xì)胞的排列層次，對(duì)染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在HE染色中，凋亡的神經(jīng)元會(huì)表現(xiàn)出核固縮、核破裂以及空泡化；在Nissl染色中，存活的神經(jīng)元具有較強(qiáng)的蛋白合成功能，呈現(xiàn)深藍(lán)色，凋亡的神經(jīng)元無(wú)法合成蛋白質(zhì)，故而Nissl小體數(shù)量少且著色淡。

3.5 免疫組織化學(xué)染色常規(guī)切片脫蠟、水化，后使用PBS洗滌3遍，每次5 min。將0.01%檸檬酸鈉緩沖液覆蓋在切片上孵育5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，洗滌3遍后將3%過(guò)氧化氫覆蓋在切片上孵育5 min，依次封閉，清洗，滴加Ⅰ抗（GFAP或Iba-1抗體，1∶100），將切片4°C下孵育過(guò)夜，次日滴加適量生物素標(biāo)記Ⅱ抗工作液，最后在顯微鏡下觀察顯色情況，于20倍鏡下拍照并計(jì)數(shù)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色在各組中檢測(cè)GFAP和Iba-1的表達(dá)。其中免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，顏色越深提示該蛋白表達(dá)量越多。

對(duì)斷路器聲音異?；蚬滑F(xiàn)象的處理，長(zhǎng)時(shí)間維修斷路器的經(jīng)驗(yàn)讓我們了解到對(duì)斷路器該現(xiàn)象檢修應(yīng)當(dāng)按照一問(wèn)、二試、三摸的步驟進(jìn)行。一問(wèn)，檢修人員應(yīng)當(dāng)向運(yùn)行人員進(jìn)行詳細(xì)的詢問(wèn)，依據(jù)詢問(wèn)結(jié)果對(duì)斷路器出現(xiàn)故障進(jìn)行初步判斷，然后備起檢修所需要的用品，制定檢修策略。二試，通過(guò)分合動(dòng)作試壓使斷路器處于工作狀態(tài)，通過(guò)觀察尋找故障可能出現(xiàn)的地點(diǎn)，通過(guò)綜合判斷，可以快速的對(duì)引起故障的原因以及故障地點(diǎn)做出準(zhǔn)確判斷，提高了工作效率。三摸，當(dāng)斷路器出現(xiàn)過(guò)熱現(xiàn)象時(shí)，檢修人員可以通過(guò)觸摸發(fā)現(xiàn)斷路器故障，并對(duì)故障可能發(fā)生的地點(diǎn)進(jìn)行初步判斷。進(jìn)而對(duì)斷路器的故障進(jìn)行處理。

3.6 大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β含量的測(cè)定促炎因子（如細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α）通常與膠質(zhì)細(xì)胞激活密切相關(guān)，涉及多種神經(jīng)退行性疾病。為評(píng)估乙酰化對(duì)ROSC后神經(jīng)炎癥的影響，采用ELISA檢測(cè)海馬組織炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平。分離大鼠海馬組織，在含有蛋白酶抑制劑和的裂解液中研磨，提取蛋白上清，并根據(jù)制造商的說(shuō)明，定量分析炎癥因子濃度。

3.7 Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的含量具體操作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［10］，取各組大鼠海馬組織，RIPA裂解法提取總蛋白，取20 μg每孔上樣，進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉，分別加入各Ⅰ抗中孵育過(guò)夜，次日使用TBST洗后加入山羊抗兔Ⅱ抗孵育，最后在成像系統(tǒng)中觀察條帶并拍照，結(jié)果使用ImageJ軟件灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）進(jìn)行描述。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不滿足則采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ITSA-1促進(jìn)CA后大鼠恢復(fù)自主循環(huán)

在誘導(dǎo)CA前，3組大鼠的體重、心率和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；sham組10只大鼠由于在注射肌松藥的同時(shí)進(jìn)行機(jī)械通氣，故未發(fā)生CA，無(wú)心肺復(fù)蘇相關(guān)數(shù)據(jù)，而model組和ITSA組中所有大鼠均成功誘導(dǎo)CA，誘發(fā)CA的時(shí)間分別為（327.30±17.34）s和（322.60±16.87）s（P＜0.05）；ITSA組大鼠心電靜止（pulseless electrical activity，PEA）時(shí)間顯著 短 于model組，分 別 為（195.70±40.95）s和（245.80±64.52）s（P＜0.05）；在BLS方面，model組大鼠復(fù)蘇成功需（268.70±54.47）s，而ITSA組大鼠僅需（180.80±18.87）s，ITSA組大鼠BLS時(shí)間顯著短于model組（P＜0.05）；此外，model組大鼠復(fù)蘇成功需使用腎上腺素（1.28±0.45）μg，而ITSA組大鼠僅需要（0.66±0.31）μg，用量顯著少于model組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠生理參數(shù)和心肺復(fù)蘇參數(shù)Table 1.The physiological parameters and cardiopulmonary resuscitation parameters of rats in each group（n=10）

2 ITSA-1提高ROSC后大鼠72 h生存率

術(shù)后結(jié)果顯示，sham組大鼠全過(guò)程中血壓維持在正常范圍內(nèi)，并無(wú)大幅起落；而另外兩組重血壓均有顯著變化，隨著肌松藥物注射之后，兩組大鼠的血壓均發(fā)生逐漸降低，降至電機(jī)械分離后維持在低位。但I(xiàn)TSA組大鼠的血壓在基礎(chǔ)生命支持期間能夠更快上升，上升后較長(zhǎng)時(shí)間高于model組，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Representative traces of mean arterial pressure（MAP）for 60 min after cardiac arrest..圖1心臟停搏后各組大鼠血壓波動(dòng)曲線圖

圖2 顯示術(shù)后72 h Kaplan-Meier生存曲線的結(jié)果，sham組大鼠沒(méi)有發(fā)生死亡事件，均為存活狀態(tài)；model組大鼠術(shù)后72 h共死亡5只，而ITSA組大鼠死亡3只，死亡時(shí)間大多發(fā)生在術(shù)后24 h內(nèi)。ITSA組大鼠72 h存活率為70%，顯著高于model組的50%（P=0.02）。

Figure 2.ITSA-1 increased the 72 h survival rate of mice after ROSC.圖2 ITSA-1提高了大鼠ROSC后72 h存活率

3 ITSA-1改善ROSC后大鼠NDS評(píng)分

我們使用NDS評(píng)估CA后的神經(jīng)功能，如圖3所示，sham組大鼠全程均未檢測(cè)到神經(jīng)功能缺損癥狀，而ITSA組ROSC后24 h的評(píng)分為41.20±7.46，顯著好于model組的16.10±6.65（P＜0.05）；ROSC后48 h，ITSA組的評(píng)分為43.00±9.49，顯著好于model組的17.20±7.09；ROSC后72 h，ITSA組的評(píng)分 為48.60±10.71，優(yōu) 于model組 的23.40±9.57（P＜0.05）。

4 ITSA-1促進(jìn)ROSC后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活

Figure 3.ITSA-1 improved neurological function in rats 24，48 and 72 h after ROSC.A：the neurological deficit score（NDS）of rats in each group 24 h after ROSC；B：the NDS of rats in each group 48 h after ROSC；C：the NDS of rats in each group 72 h after ROSC.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖3 ITSA-1改善大鼠ROSC后24、48和72 h的神經(jīng)功能

圖4 A顯示，HE染色中sham組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，纖維結(jié)構(gòu)正常，核染色較淺，細(xì)胞輪廓清晰，分布較均勻；model組神經(jīng)元排列紊亂，分布不均，層數(shù)減少且并觀察到大量神經(jīng)元壞死，核固縮和空泡形成，失去典型的多邊形形狀；而給予ITSA處理可減輕這些病理性損傷，減少大腦神經(jīng)元的核固縮和空泡形成。

Nissl染色用于顯示神經(jīng)細(xì)胞中的Nissl小體，可以反映神經(jīng)細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的強(qiáng)度，評(píng)估神經(jīng)元存活的數(shù)量。如圖4B所示，sham組海馬CA1區(qū)中神經(jīng)元排列整齊致密形態(tài)正常，細(xì)胞核可見(jiàn)，胞質(zhì)著色均勻，可以觀察到大量深藍(lán)色顆粒狀的Nissl小體；與sham組相比，model組中正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，著色淺淡不均勻，排列極不規(guī)則，存活神經(jīng)元數(shù)量顯著減少；與model組相比，ITSA組中分布相對(duì)較多的Nissl小體，正常神經(jīng)元比例增多，胞質(zhì)著色較深，神經(jīng)元存活數(shù)量有所增加。

Figure 4.ITSA-1 increased neuronal survival in rat hippocampal CA1 area after ROSC.A：representative images of HE staining in sham group，model group and ITSA group，and quantitative analysis of injured neurons；B：representative images of Nissl staining in sham group，model group and ITSA group，and quantitative analysis of Nissl body.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖4 ITSA-1增加ROSC后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活

5 ITSA-1減少ROSC后大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)

免疫組化染色結(jié)果如圖5所示，sham組中星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1散在分布于海馬CA1區(qū)內(nèi)，呈靜息形態(tài)，胞體較??；而model組中可見(jiàn)海馬CA1區(qū)內(nèi)GFAP和Iba-1的免疫反應(yīng)性顯著增加，細(xì)胞體增大，突觸短而厚；與model組比較，ITSA組海馬CA1區(qū)內(nèi)GFAP和Iba-1的免疫反應(yīng)性顯著減弱，胞體較小。

6 ITSA-1減少ROSC后大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β的含量

各組大鼠ROSC后海馬組織TNF-α和IL-1β的含量如圖6所示，與sham組比較，model組大鼠海馬組織中TNF-α和IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；而與model組比較，ITSA組海馬組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。

7 ITSA-1降低ROSC后大鼠海馬廣譜乙?；郊暗蛲鱿嚓P(guān)蛋白caspase-3、Bax和cleaved caspase-3水平

Figure 5.ITSA-1 inhibited the activation of astrocytes and microglia in rat hippocampal CA1 area after ROSC.A：representative images of immunohistochemical staining of GFAP in sham group，model group and ITSA group，and quantitative analysis of GFAP positive cells in CA1 region；B：representative images of immunohistochemical staining of Iba-1 in sham group，model group and ITSA group，and quantitative analysis of Iba-1 positive cells in CA1 region.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜01 vs model group.圖5 ITSA-1抑制ROSC后大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活

Figure 6.ITSA-1 reduced the levels of TNF-α（A）and IL-1β（B）in hippocampus of rats after ROSC.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖6 ITSA-1降低ROSC后大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β水平

各組大鼠ROSC后海馬組織廣譜乙?；郊暗蛲鱿嚓P(guān)蛋白的表達(dá)量如圖7所示。Western blot結(jié)果顯示，大鼠CA后腦組織廣譜乙?；鞍椎谋磉_(dá)量顯著增加，而給予激動(dòng)劑藥物ITSA-1能夠顯著減少腦組織蛋白的廣譜乙?；≒＜0.05）。此外，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）；與model組比較，ITSA組大鼠海馬組織中促凋亡蛋白的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量改變不顯著。

討 論

CA主要的損傷機(jī)制是全身多器官的缺血再灌注，停搏的持續(xù)時(shí)間決定了原發(fā)性損傷，而ROSC后的再灌注過(guò)程往往會(huì)造成更為嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，其中炎癥因子的釋放及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的瀑布式激活，是造成神經(jīng)元損害的主要原因［11-12］。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中的非神經(jīng)元細(xì)胞，對(duì)大腦的正常發(fā)育和功能至關(guān)重要。在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)大腦炎癥反應(yīng)的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。Campanella等［13］在對(duì)大鼠腦梗組織進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定時(shí)，觀察到有大量膠質(zhì)細(xì)胞激活，這會(huì)誘發(fā)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步加劇腦組織中的炎癥反應(yīng)，使神經(jīng)功能惡化。在大腦缺血再灌注損傷中，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)上調(diào)糖酵解能力來(lái)抵抗缺氧，隨后導(dǎo)致谷氨酰胺及炎癥因子的釋放量顯著增加，同時(shí)還會(huì)通過(guò)縫隙連接向其他健康組織發(fā)送促凋亡信號(hào)，進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞［14］。在缺氧的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)從靜息態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镸1極化，激活信號(hào)級(jí)聯(lián)鏈，釋放各種炎癥因子。如果能夠有效抑制缺氧后神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞活化，則可抑制腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元損傷。

Figure 7.ITSA-1 inhibited the levels of pan-acetylation and apoptosis-related proteins in the hippocampus of rats after ROSC.A：representative image and quantitative analysis of pan-acetylation in the hippocampus of rats after ROSC；B：caspase-3，Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 protein levels in the hippocampus of rats after ROSC.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖7 ITSA-1抑制ROSC后大鼠海馬廣譜乙酰化及caspase-3、Bax和cleaved caspase-3水平

組蛋白乙酰化修飾在再灌注期間發(fā)揮什么作用，是否通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、能量平衡和氧化應(yīng)激的影響從而調(diào)節(jié)。以往HDAC通路在生物體進(jìn)化過(guò)程中偏向保守，且在缺血缺氧損傷以及氧化應(yīng)激等條件下，維持細(xì)胞生存發(fā)揮著重要作用。適當(dāng)?shù)募せ頗DAC能夠延長(zhǎng)壽命，幫助細(xì)胞在惡劣條件下增強(qiáng)適應(yīng)力，調(diào)控自噬改善能量代謝，抑制應(yīng)激相關(guān)性炎癥。在慢性缺氧過(guò)程中HDAC的活性會(huì)顯著降低，從而導(dǎo)致組蛋白高度乙?；?，進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄［15-16］。目前研究表明小分子藥物ITSA-1能減少組蛋白乙酰化，從而阻止促炎基因的轉(zhuǎn)錄激活，減少炎癥因子等損傷物質(zhì)的釋放［17］。但其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究結(jié)果證實(shí)，ROSC后星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，腦中炎癥因子釋放顯著增加，而給予ITSA-1處理能夠逆轉(zhuǎn)這些改變，提示大腦中高水平的組蛋白乙酰化狀態(tài)可能是大鼠心肺復(fù)蘇后腦損傷的重要原因。

本研究通過(guò)維庫(kù)溴銨誘導(dǎo)窒息建立大鼠CA模型，模擬患者不可除顫型CA的病理生理學(xué)機(jī)制，研究證明HDAC激動(dòng)劑ITSA-1可有效減輕大鼠復(fù)蘇后腦損傷。通過(guò)觀察心臟電生理變化、復(fù)蘇后神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織結(jié)構(gòu)變化、炎癥因子及凋亡基因改變程度評(píng)價(jià)大鼠的再灌注損傷。研究結(jié)果顯示ITSA-1在CA疾病中發(fā)揮了保護(hù)的作用，能夠減輕大鼠ROSC后腦損傷，提高存活率，抑制炎癥因子的釋放，減少神經(jīng)元的凋亡。相較model組，ITSA組PEA時(shí)間持續(xù)更短，自主循環(huán)恢復(fù)更快，所需要的腎上腺素劑量更少。由于神經(jīng)元的缺氧損傷通常會(huì)伴隨著星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的激活，增生后會(huì)清理凋亡神經(jīng)元。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色在各組中檢測(cè)GFAP和Iba-1的表達(dá)。檢測(cè)到大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活。而ITSA-1可能抑制ROSC后早期的炎癥反應(yīng)，減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步激活，發(fā)揮保護(hù)作用。潛在機(jī)制可能與其激活HDAC蛋白酶活性，減少組蛋白乙?；?，抑制ROSC后腦膠質(zhì)細(xì)胞增生，減少腦組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)，這為大鼠CA心肺復(fù)蘇后腦損傷的藥物防治提供了參考。