人牙髓干細胞無血清培養(yǎng)方法的研究進展

付恒怡 汪成林

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 成都 610041

人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）最先由Mooney等[1]描述為干細胞，后于2000年證實存在于人牙髓組織中[2]，是一種具有干細胞性質的未分化細胞，具有多向分化潛能，在再生醫(yī)學方面具有巨大的潛力[3]。目前，hDPSCs作為一種非侵入來源的干細胞[4]，已被應用于治療Ⅰ型糖尿病、神經(jīng)疾病、免疫缺陷疾病以及骨和軟骨疾病等。但人牙髓中干細胞含量極低，必須在體外進行擴增，以獲得足夠的細胞數(shù)量來滿足應用需求。

Gronthos等[2]最初從人牙髓組織分離出牙髓干細胞后，其體外培養(yǎng)的方法采用αMEM（α modification of Eagle’smedium），添加20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以及多種抗生素。

目前，國內(nèi)外研究者仍主要通過在基礎培養(yǎng)基中添加一定濃度的胎牛血清及抗生素培養(yǎng)及擴增牙髓干細胞，但同時也發(fā)展出多種不含血清的培養(yǎng)方法。

1 干細胞培養(yǎng)方法的介紹和發(fā)展

常見的干細胞培養(yǎng)方法，依據(jù)其是否使用血清，主要分為兩類，即含血清培養(yǎng)方法和不含血清培養(yǎng)方法。

1.1 含血清培養(yǎng)方法

1.1.1 FBS FBS是體外培養(yǎng)細胞的重要補充劑，含有必要的成分，如激素、營養(yǎng)素、生長因子等。然而，除涉及動物倫理道德問題外，由于其為極其復雜的混合物，含有許多成分未知的組成部分，對其臨床應用存在限制。首先，F(xiàn)BS存在攜帶細菌、病毒、支原體、蛋白傳染性疾病或朊病毒的風險。其次，血清可能含有不同數(shù)量的內(nèi)毒素、血紅蛋白和其他有害因子，影響產(chǎn)品的安全性[5]。此外，不同批次血清的質量和蛋白質濃度存在差異[6]，影響實驗的重復性。更有研究[7]表明，F(xiàn)BS中包含的蛋白質和多肽即使在最低濃度下也可能會在培養(yǎng)過程中與干細胞結合，使干細胞受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體，引發(fā)免疫反應，并可能在需要重復注射的情況下導致移植細胞的排斥反應[8]。

1.1.2 人來源血清 近年來，有學者[9]認為，從成人外周血和臍帶血（umbilical cord，UC）中制備富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）和乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）在體外擴增干細胞，實驗證明其比FBS具有更強的促有絲分裂作用，對干細胞遷移具有更好的促進效果。他們認為，這些人來源血清培養(yǎng)基可以替代含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，用于體外培養(yǎng)及冷凍保存人和大鼠的牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。而在幾種血漿中，臍帶血來源的富血小板血漿在增殖、遷移方面更加具有優(yōu)勢，如0.1%濃度的臍帶血來源的富血小板血漿對DPSCs的增殖作用可超過培養(yǎng)基中添加的多種生長因子的作用。Nakashima等[10]進行牙髓再生臨床試驗時也采用10%自體血清作為DMEM（dulbecco’s modification of Eagle’s medium）的添加物而培養(yǎng)hDPSCs。此類培養(yǎng)基均為人來源血清，有自體應用前景，但其化學成分仍不明確，且使用過程中需要大量外周血或臍帶血，無法滿足大規(guī)模擴增干細胞的需求。

1.2 不含血清培養(yǎng)方法

為了擺脫FBS的倫理爭議和安全隱患，以及人來源血清的供需矛盾，迫切需要開發(fā)應用無血清培養(yǎng)基。然而，無血清培養(yǎng)基對實驗技術要求更高，技術體系暫不成熟，且有研究[11]顯示，無血清培養(yǎng)的DPSCs對外源性細胞毒性刺激如H2O2和紫外光更敏感，提示：不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞可能易受外源性細胞毒性的影響，在一定程度上影響干細胞的生長。因此，無血清培養(yǎng)基未能在市場上廣泛使用，還需要進一步的研究。

盡管如此，目前市場上也已開發(fā)出多種無血清培養(yǎng)基，適合不同細胞的生長增殖，且均由營養(yǎng)完全的基礎培養(yǎng)基添加一定數(shù)量的添加因子均勻混合組成?；A培養(yǎng)基的成分已知，常見的有MEM（modification of Eagle’s medium）、DMEM等。添加因子按其功能的不同一般分為5類[12]：1）促貼壁因子，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。2）激素和促生長因子，激素如胰島素；生長因子包括表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等。3）結合蛋白和轉運蛋白。4）酶抑制劑：常用大豆胰酶抑制劑。5）其他微量元素，如硒等。

無血清培養(yǎng)基經(jīng)過多年的發(fā)展，目前已開發(fā)出完全不含血清、無蛋白或蛋白含量極低的培養(yǎng)基，即“雙無培養(yǎng)基”[12]，具有以下優(yōu)勢：1）內(nèi)容物明確，增加了實驗的科學性和可靠性；2）成分比例一致，增加了實驗的重復性；3）無蛋白成分，有利于純化和下游加工；4）從根本上消除了血清源性或蛋白源性污染。

2 hDPSCs的無血清培養(yǎng)方法

2.1 無血清培養(yǎng)方法分類

無血清培養(yǎng)hDPSCs的方法主要可以分為2類：1）血清條件下進行初代培養(yǎng)，后更換至無血清培養(yǎng)基中；2）全程無血清條件培養(yǎng)。

普遍認為，在運送組織樣本以及在原代培養(yǎng)分離干細胞時，F(xiàn)BS的使用是必需的[13]，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。同時，也有研究[13]表明，無血清培養(yǎng)的DPSCs對外源性細胞毒性刺激如H2O2和紫外光更敏感，這表明不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞可能易受外源性細胞毒性的影響。因此，在大多數(shù)有關無血清培養(yǎng)DPSCs的實驗[12]中，研究者們?nèi)匀贿x擇第一種方法，即先用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間，再更換到無血清培養(yǎng)基中。

然而，Mochizuki等[11]認為，在傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細胞即使只有一次也會引起安全問題；因此，他們在整個hDPSCs的培養(yǎng)過程中均未使用血清，結果發(fā)現(xiàn)細胞黏附力降低，形態(tài)變薄，提示：原代培養(yǎng)使用無血清培養(yǎng)基會對細胞生長產(chǎn)生或多或少的不利影響。Abdel Moniem等[14]在干細胞培養(yǎng)過程中只有在傳代培養(yǎng)細胞胰蛋白酶失活時使用了最低濃度的FBS，他們建議在之后的研究中嘗試采用機械分離或用危害小的蛋白酶（如重組胰蛋白酶）取代胰蛋白酶，以確保細胞不會受到任何血清來源的影響。最近有研究[15]便采用了后者的方法，運用消化酶AccutaseTM建立了一種從分離到培養(yǎng)和分化誘導全過程的無血清培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的hDPSCs可以和在常規(guī)培養(yǎng)條件下一樣增殖，提示全程無血清條件培養(yǎng)方法具有一定的可行性。

2.2 無血清培養(yǎng)基添加因子的研究進展

有一些有關基礎培養(yǎng)基中添加因子組成和配比的研究，如Hirata等[13]嘗試對比4種添加不同因子的無血清培養(yǎng)基，結果發(fā)現(xiàn)含1% 胰島素轉鐵蛋白硒（insulin transferrin selenium，ITS）-Ⅹ和100 mg·mL-1胚胎營養(yǎng)因子（embryo trophic factor，ETF）最適合hDPSCs的培養(yǎng)，具有較高的存活率和增殖率，且干細胞標志物中表達最強。Machado等[16]在有血清和無血清的條件下，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的葡萄糖和谷氨酰胺，發(fā)現(xiàn)在去谷氨酰胺的無血清低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞具有較好的形態(tài)和活力。

有研究表明，在培養(yǎng)hDPSCs時應用較多的有幾種雙無培養(yǎng)基。Bakopoulou等[17]對2種商業(yè)化的雙無培養(yǎng)體系StemPro和StemMacs進行了評估并建議作為含血清培養(yǎng)基的替代品。然而，考慮到制造商往往不提供關于配方的信息，可能會導致樣本之間缺乏直接比較，還需要進一步的測試。Xiao等[18]使用E8（Essential 8）培養(yǎng)基進行hDPSCs的細胞培養(yǎng)實驗。這是一種相對成熟的無血清培養(yǎng)基，常用于臨床和研究用途的誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）培養(yǎng)，其中一些成分如重組人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉化生長因子β1和胰島素對hDPSCs的維持和生長是必要的，具有很強的實用性。有研究[14]報道，一種雙無培養(yǎng)基的新配方，添加因子包括bFGF、ITS、抗壞血酸、β-巰基乙醇和膽固醇，成功地增加了hDPSCs的增殖潛能和干性，是一種安全且具有應用潛力的血清培養(yǎng)基替代品。

綜上，完全無血清的培養(yǎng)方法顯然能夠徹底避免血清的倫理及安全問題，但也可能會對hDPSCs的穩(wěn)定生長產(chǎn)生一定的影響。這需要深入的研究論證，并為解決這些問題尋找無血清培養(yǎng)基更適合的添加因子，例如ITS-Ⅹ、ETF等。對于制造商較為成熟的無血清培養(yǎng)基，由于其配方信息未知，也需要經(jīng)過進一步的測試，以明確其對hDPSCs生物性能的影響。

3 無血清培養(yǎng)hDPSCs的細胞特性

3.1 細胞形態(tài)

研究[17]顯示，用無血清培養(yǎng)基擴增的hDPSCs表現(xiàn)出非常均勻的形態(tài)，梭形細胞排列整齊。相反，含F(xiàn)BS 培養(yǎng)基擴增的hDPSCs表現(xiàn)為形狀和大小不一。Mochizuki等[11]早在原代培養(yǎng)中就開始使用無血清培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)雖然單個細胞大小與血清培養(yǎng)的細胞相似，但黏附率較低，形態(tài)明顯變薄，且呈梭形。Qu等[19]以及鐘萌等[20]的實驗結果均證實了這一觀點，即與含F(xiàn)BS培養(yǎng)基相比，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hDPSCs顯示出更細長、更薄、更立體、更近紡錘形的成纖維細胞形態(tài)。

3.2 細胞增殖

與含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基相比，關于無血清培養(yǎng)基對細胞增殖的影響目前存在相互矛盾的結論，這可能是由研究中供體的不同特性、使用的培養(yǎng)基的成分不同或培養(yǎng)方法的差異所致。早期有學者[21]應用低血清培養(yǎng)基，觀察到其分離后的貼壁細胞數(shù)量明顯低于高血清培養(yǎng)基，認為低血清培養(yǎng)基可能會對hDPSCs的增殖產(chǎn)生不利影響。有研究[13]通過增殖實驗發(fā)現(xiàn)，幾種無血清配方的培養(yǎng)基培養(yǎng)的hDPSCs增殖能力遠低于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hDPSCs。但在無血清培養(yǎng)基中，其中同時添加1% ITS-Ⅹ和100 mg·mL-1ETF 與單獨添加1%ITS-Ⅹ或100 mg·mL-1ETF等配方相比，增殖能力較高且具有明顯差異。有學者[21]應用低血清培養(yǎng)基，觀察到其分離后的貼壁細胞數(shù)量明顯低于高血清培養(yǎng)基，認為低血清培養(yǎng)基可能會對hDPSCs的增殖產(chǎn)生不利影響。

然而，Bakopoulou等[17]發(fā)現(xiàn)在無血清條件下擴增的hDPSCs在連續(xù)傳代過程中產(chǎn)生了與血清培養(yǎng)相似的生長模式，且在完成不超過3代（早期）傳代后，已能夠實現(xiàn)超過3 000萬個細胞的細胞產(chǎn)量。Fujii等[22]的實驗通過分析hDPSCs基因表達譜，發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中，胎盤生長因子和抑制素等與細胞增殖相關的基因表達上調。有研究[19]證實，hDPSCs在無血清培養(yǎng)基中的擴增方式與血清培養(yǎng)在早期傳代時沒有明顯差異，但前者中細胞集落數(shù)量較少。在培養(yǎng)基的添加因子方面，Xiao等[18]發(fā)現(xiàn)，含抗壞血酸和ETF的特殊無血清培養(yǎng)基，可能通過加快細胞分裂速度以及降低細胞凋亡率，來提高hDPSCs的增殖率。

采用全程無血清的培養(yǎng)方法時，Mochizuki等[11]報道雖然無血清培養(yǎng)基原代培養(yǎng)條件下hDPSCs在培養(yǎng)皿上黏附需要更長的時間，但傳代培養(yǎng)時無血清培養(yǎng)條件下的hDPSCs比有血清培養(yǎng)條件下具有更強的增殖能力。另有研究[14]通過實驗發(fā)現(xiàn)，hDPSCs在無血清培養(yǎng)基中的增殖率明顯提高，與常規(guī)10%FBS培養(yǎng)基相比，在培養(yǎng)第7天時分離獲得的細胞數(shù)量沒有顯著差異，但在培養(yǎng)第14天時獲得細胞數(shù)量更多。此外，值得注意的是，Mochizuki等[11]發(fā)現(xiàn)，當細胞達到過度融合時，無血清細胞形成了多層結構，增殖受阻，不能傳代，而血清培養(yǎng)細胞則為單層結構。通過觀察，他們認為這種異常的細胞增殖行為可能由于這些細胞的“接觸抑制”減弱，異種血清成分的存在可能有助于接觸抑制，并控制細胞的正常增殖行為。

另外，體外培養(yǎng)hDPSCs時要注意其存在明顯的與年齡有關的細胞增殖的差異，研究[13]表明，年齡相關的衰老影響hDPSCs的增殖和分化能力。和年輕供體相比，年老的供體來源的hDPSCs增殖能力明顯下降。

由上述研究分析可知，無血清培養(yǎng)基對hDPSCs增殖的影響存在相互矛盾的結論，這可能是由研究中供體的特性不同、培養(yǎng)基成分不同或培養(yǎng)方法的差異所致。新的研究結果提示，在體外培養(yǎng)hDPSCs時應盡可能選用年輕供體，無血清培養(yǎng)基的添加因子可以適當選用ITS-Ⅹ、ETF以及抗壞血酸等。采用無血清培養(yǎng)方法擴增細胞時早期增殖能力可能會相對較弱，傳代培養(yǎng)后會逐漸增強，甚至超過含血清培養(yǎng)方法的細胞。但應注意避免過度培養(yǎng)至過度融合，因為這會破壞細胞的增殖和進一步培養(yǎng)的潛力。

3.3 細胞干性

多個課題組研究了無血清培養(yǎng)的hDPSCs的MSC相關的各種標記物，通過其表達差別來探究無血清培養(yǎng)對細胞干性的影響。

3.3.1 干細胞重要標記物的表達 CD146具有黏附分子特性，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移、治療和預后密切相關，是某些內(nèi)皮、平滑肌細胞和血管周圍間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的標記物[23]。低血清或無血清培養(yǎng)基擴增的hDSPCs的研究[17,21]發(fā)現(xiàn)，表面CD146表達明顯減少。同時，更換使用含有大量血清的培養(yǎng)基可以恢復65%以上的CD146陽性細胞，但不能完全恢復CD146的表達。類似的研究[24]也證實在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠DPSCs存在CD146表達。

CD105是一種跨膜糖蛋白，通常被認為是MSC最重要的標記物之一[24]。與常規(guī)血清培養(yǎng)相比，研究[17]顯示，無血清條件早期培養(yǎng)（2～3代）hDPSCs時CD105的表達減少，而在長時間傳代后（6～7代，10～11代）顯示出更明顯的下調。另有學者[19,25]進行細胞鑒定時發(fā)現(xiàn)，無血清培養(yǎng)基擴增的hDPSCs呈現(xiàn)CD105陽性，但隨著傳代次數(shù)的增加（即使是僅3代之后），CD105陽性的hDPSCs的百分率明顯降低，而血清培養(yǎng)的細胞則多呈陽性。有趣的是，將無血清培養(yǎng)的hDPSCs換至添加血清的培養(yǎng)基中，可恢復CD105的表達。盡管在無血清培養(yǎng)基中擴增的hDPSCs 的CD105表達水平降低，但仍可保持功能性的MSC表型。并且，考慮到人血清是模擬細胞用于移植時體內(nèi)條件的金標準，CD105的表達很可能在體內(nèi)移植時暴露在血清中后得以恢復[19]。與此相反，另一項研究[26]顯示，CD105在無血清培養(yǎng)hDPSCs中的表達非常低且培養(yǎng)過程中沒有明顯改變。

CD34是早期分離的MSC的重要標記物，與高集落形成效率和延長增殖能力相關，但其表達隨著傳代而逐漸減弱。有報道稱，無血清培養(yǎng)下的hDPSCs造血標志物CD45及CD34表達呈陰性[14,17,19,27]，但長期擴增后CD34表達明顯上調[17,28]，與先前報告[29]一致。

另外，從傳代早期到后期，公認的MSC標記物如CD90和CD73在基于血清和無血清培養(yǎng)條件下都能穩(wěn)定地表達。然而，有學者[17]發(fā)現(xiàn)，其他MSC標記如Stro-1和胚胎標記階段特異性Embyronic抗原（stage-specific Embyronic antigen，SSEA）-1和SSEA-4，在無血清培養(yǎng)多代后顯示出明顯的下調，是否會因此而影響hDPSCs的干性，需要進一步實驗予以補充完善。

3.3.2 成骨、成軟骨及成脂標志物的表達 早期研究[30]表明，成骨和成軟骨受到Runx2轉錄調控通路調控，軟骨形成受到SOX-9的強烈調控，而成脂受到其主要轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）-γ調控。研究[17]顯示，無血清條件下擴增hDPSCs會導致其成骨標志物Runx2表達增加，成軟骨標志物SOX-9和成脂標志物PPAR-γ完全消失，而對比含血清條件下擴增只有成骨標志物的變化，成脂和成軟骨的變化不明顯。經(jīng)過多次傳代后，大多數(shù)最初高表達的成骨標志物的表達減少，成軟骨標志物表達顯著減少或完全消失。因此，學者們提出hDPSCs只能在早期傳代時確定可以保持高的成骨及成軟骨潛力。然而，也有學者[18-22]進行誘導分化實驗，結果顯示，在誘導分化刺激存在的情況下，無血清培養(yǎng)的hDPSCs中Runx2和PPAR-γ的表達水平均較高，提示無血清培養(yǎng)條件或能有效地維持hDPSCs向成骨和成脂組織的多向分化潛能。研究[14]顯示，無血清培養(yǎng)細胞的干細胞標記OCT4、SOX和NANOG基因的表達顯著上調，提示細胞的干性增強，但可能是由于培養(yǎng)基中添加因子的原因。實驗[22]發(fā)現(xiàn)，在誘導成骨后，在無血清培養(yǎng)基中生長的hDPSCs誘導堿性磷酸酶活性和鈣化結節(jié)形成水平均高于有血清培養(yǎng)基組，表明hDPSCs在無血清培養(yǎng)條件下保持了成骨分化潛能。

3.3.3 神經(jīng)相關標記物的表達 除此之外，趨化因子CXC亞家族受體（CXC subfamily receptor，CXCR）3與神經(jīng)炎性反應有關，其陽性細胞在牙髓免疫反應中可被CXC趨化因子配體10吸引[31]。有學者[28]觀察無血清培養(yǎng)的貼壁hDPSCs發(fā)現(xiàn)，70%的細胞表達神經(jīng)細胞黏附分子CD56，30%表達轉鐵蛋白受體CD71。另有少部分hDPSCs表達CXCR3陽性，這部分hDPSCs可能具有遷移到需要修復區(qū)域的能力，可應用于細胞治療中。

同時，在神經(jīng)分化方面，多個研究團隊[21,24,28,32-35]觀察到，在無血清培養(yǎng)的情況下，來自不同患者供體的hDPSCs可以長期培養(yǎng)，并表達神經(jīng)前體細胞標記物Nestin[21,27,29-32]。同時，其他神經(jīng)標記物如微管相關蛋白（microtubule associated protein，MAP）2、微管蛋白β3 等也被證實高度表達[15,29,32]。研究[15,29,31]顯示，無血清培養(yǎng)條件下，神經(jīng)元誘導刺激hDPSCs后可以獲得類似表型的成熟神經(jīng)元。有學者[24,32,34]通過觀察細胞形態(tài)學變化、MAP2的表達、以及神經(jīng)元標志物的激活，證實培養(yǎng)過程中若缺乏血清和生長因子，可能會導致hDPSCs向神經(jīng)元樣細胞向分化，獲得類似表型的成熟神經(jīng)元。

3.3.4 其他分化方向 除以上方向之外，還有研究揭示了無血清條件下誘導hDPSCs成其他細胞系的可能性。學者們[33-34]在無血清條件下成功誘導hDPSCs分化為高純度的肝細胞樣細胞，以及胰島細胞系。除此之外，還有學者[19]進行細胞培養(yǎng)以及體外血管生成實驗證實，無血清條件培養(yǎng)的hDPSCs在傳代至第2代和第6代時血管內(nèi)皮生長因子A的分泌明顯增加，提示無血清培養(yǎng)基可能比含血清培養(yǎng)基更能促進毛細管樣的形成。

由上述結果可知，無血清培養(yǎng)的hDPSCs與含血清培養(yǎng)的hDPSCs相比，其多能分化潛能沒有明顯的差異，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出典型的MSC特征，且更容易誘導神經(jīng)分化以及毛細管樣形成。hDPSCs作為從牙齒組織中提取的干細胞，在無血清條件下增殖分化，對口腔科學和再生醫(yī)學具有重要的意義。

4 hDPSCs無血清培養(yǎng)方法的其他應用

4.1 三維培養(yǎng)系統(tǒng)

在干細胞研究中，二維單層細胞培養(yǎng)系統(tǒng)便于對干細胞和測試其多能性等特性的鑒定。但是，相比于單層培養(yǎng)系統(tǒng)，三維球體培養(yǎng)系統(tǒng)更能反映體內(nèi)細胞環(huán)境和細胞行為。以往的三維培養(yǎng)系統(tǒng)多采用血清培養(yǎng)的方法，但由于使用血清存在安全隱患，不適用于臨床，學者們[31]對無血清三維培養(yǎng)系統(tǒng)進行了多項改進。

相較于骨髓MSC，hDPSCs具有更高的神經(jīng)球形成和分化為神經(jīng)元的潛力，因為其與神經(jīng)嵴細胞有著共同的起源。有學者[31]發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中人牙髓細胞24 h即可以自發(fā)形成球體，且可以存活15周以上。據(jù)報道，EGF和/或bFGF對細胞增殖及形成球形結構具有作用[15,29]。研究[15]顯示，hDPSCs在全程無血清培養(yǎng)條件下可以在懸液中生成神經(jīng)球，并分化為神經(jīng)細胞，但傳代培養(yǎng)后形成的神經(jīng)球數(shù)目變少，形態(tài)變小。因此，在無血清培養(yǎng)基中，hDPSCs可以增殖并生成神經(jīng)球，但神經(jīng)球的自我更新能力有限。

這種球體模型為探索干細胞穩(wěn)態(tài)和組織結構的分子基礎提供了研究方法，且hDPSCs在無血清條件下生成神經(jīng)球的特點，未來可能用于臨床上神經(jīng)元退行性疾病的治療。

4.2 冷凍保存

在再生醫(yī)學的臨床應用過程中，簡單可靠的活細胞冷凍保存方法是非常重要的。傳統(tǒng)的冷凍方法一般含有血清及10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。但血清存在安全隱患，且DMSO具有細胞毒性，在干細胞凍存中應盡量減少使用濃度或不使用。

Lee等[35]推薦應用磁冷凍法儲存hDPSCs，通過實驗對比不同的凍存液和凍存條件的效果，發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中加入最低濃度的DMSO同時處于磁場下進行冷凍時，解凍細胞的貼壁能力、增殖能力和干細胞標志物的表達均得到較好的保存，且具有與新鮮未凍存hDPSCs相同的分化潛能。Mochizuki等[11]使用無DMSO低溫保存的無血清培養(yǎng)hDPSCs進行體內(nèi)外實驗，結果表明解凍后的細胞表現(xiàn)出與正常細胞相似的干細胞特性和增殖行為。

目前，此類研究結果仍然較少，不過仍然提示無血清培養(yǎng)基可應用于hDPSCs的超低溫保存，具有重要的臨床應用價值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。