牙本質作為骨修復材料的研究進展

李嫣斐 張新春

中山大學附屬口腔醫(yī)院·光華口腔醫(yī)學院修復科 廣東省口腔醫(yī)學重點實驗室 廣州 510055

牙周疾病、腫瘤、感染及外傷等均可造成口腔骨組織缺損，不僅會引起口腔頜面部形態(tài)異常與功能障礙，也會為缺失牙的種植修復帶來困難。骨缺損治療的熱點之一是利用組織工程學，以生物材料為支架，搭載患者自身干細胞，聯(lián)合生長因子實現(xiàn)骨組織再生，而其瓶頸在于缺乏理想的成骨材料。目前常用的骨修復和移植的材料主要包括自體骨、同種異體骨、異種骨及人工合成骨。各種材料特性不一，但均有其各自的缺點與不足：自體骨成骨效果最佳，但來源非常有限，易引起供區(qū)并發(fā)癥，對患者造成額外的創(chuàng)傷與疼痛；同種異體骨與異種骨來源較豐富，但存在免疫排斥的風險，并可能導致交叉感染；人工合成材料不會造成疾病的傳播，但其誘導骨生成的能力較弱，且生物相容性較差。因此，尋找同時具有骨傳導性、骨誘導性、生物相容性和可吸收性等優(yōu)良特性的新型成骨材料逐漸成為研究的熱點[1]。牙本質與牙槽骨有相同的組織學來源，成分構成與骨組織相似。Yeomans與Urist[2]于1967年發(fā)現(xiàn)了兔牙本質具有骨誘導性，并提出其誘導骨再生的方式主要為軟骨內成骨[3]。近年來國內外許多研究表明，牙本質作為生物支架材料，可提供三維生長空間并模擬細胞外基質，對成骨相關細胞如成骨細胞（osteoblasts，OB）[4]、破骨細胞[5]、牙囊細胞[6]、骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）[7-8]的生長、增殖與分化有明顯的促進作用，具備良好的骨傳導、骨誘導作用及生物相容性。因此，牙本質作為一種新型骨修復材料備受關注。本文對牙本質材料的成骨機制、處理方法及其臨床應用進行綜述。

1 概述

人牙本質來源廣泛，可取自臨床治療中拔除的廢用牙或阻生齒，且富含多種骨活性分子。牙本質與牙槽骨有相同的組織學來源，均起源于胚胎時期的神經嵴細胞[9]，鈣磷含量及成分構成均與骨組織相似[10]，用作骨修復材料時具有其他材料無法比擬的天然優(yōu)勢。人牙本質主要由質量分數(shù)65%無機成分與35%有機成分構成，其中無機成分以羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）為主，還有β磷酸三鈣、無定形磷酸鈣與磷酸八鈣等。牙本質有機成分中，Ⅰ型膠原約占90%[11]，其網狀結構由3股超螺旋結構的膠原相互凝聚交聯(lián)而成，可將礦化結晶及其他有機組分，如非膠原蛋白（noncollagenous proteins，NCPs）、蛋白多糖、脂質等容納沉淀于其中。此外，牙本質中還貯藏有豐富的生物活性分子與生長因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。Avery等[12]利用酶聯(lián)免疫吸附試驗對脫礦牙本質基質（demineralised dentine matrix，DDM）中的生長因子進行定量分析，結果顯示TGF-β1含量最高，達到15.6 ng·mg-1，余依次為BMP-2、FGF、VEGF及PDGF，其含量分別為6.2、5.5、5.0、4.7 ng·mg-1。牙本質這種獨特的組成結構（無機成分、NCPs、生長因子與活性分子），賦予了其在骨組織工程學中作為生物支架搭載種子細胞，持續(xù)釋放生長因子，發(fā)揮骨誘導性以促進新骨生成的潛能[13]。

2 牙本質作為骨修復材料的成骨機制

牙本質誘導骨再生的過程是一個多種細胞參與、多種通路作用并受多種細胞因子調控的復雜網絡，其具體機制尚不明確，研究表明[14-26]可能與其無機成分及獨特的有機構成有關。

牙本質的無機成分主要為HA。Maeda等[14]證實HA可促進OB的遷移從而調節(jié)骨誘導能力的表達。牙本質中的有機物約90%為Ⅰ型膠原，不僅可為骨再生提供原料，而且還是各種生長因子的優(yōu)良載體[2]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)：Ⅰ膠原可通過細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號轉導途徑誘導BMSCs分化為OB，并調節(jié)成骨特異性轉錄因子的基因表達以增強成骨功能。在第三磨牙拔牙窩中使用Ⅰ型膠原蛋白，術后拔牙窩部位的礦化率顯著增加[16]。BMP也是牙本質中含量豐富的有機物質，是一種能促進異位成骨的分泌型多功能蛋白，參與調控OB生命周期的各個方面，包括骨原細胞擴增、OB礦化及其與破骨細胞的偶聯(lián)等，并可通過印度豪豬蛋白（indian hedgehog，IHH）來誘導BMSCs分化為軟骨細胞和骨組織，進而參與成骨和破骨的過程[17-18]。Choi等[19]在比格犬骨缺損處分別植入10、50、200 μg·mL-1的BMP，16周后通過CT檢查觀察到實驗組平均再生骨厚度與面積顯著大于對照組，且50 μg·mL-1是最佳質量濃度。BMP單獨使用時易被各種蛋白酶水解，需要與適當載體形成復合生物支架來發(fā)揮其功效。牙本質中的無機成分作為載體與BMP形成復合生物支架可有效抵抗酶的降解，并可與BMP形成緩釋系統(tǒng)，在骨缺損區(qū)持續(xù)釋放BMP，與其他生長因子相互作用，協(xié)同促進骨再生的同時提供礦化所需基質[20]。NCPs廣泛存在于牙本質、牙骨質及骨等礦化組織中，包括牙本質磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）、牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、牙本質基質蛋白（dentin matrix protein，DMP）、骨涎蛋白（bone sialoproteins，BSP）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等。NCPs在骨組織礦化過程中起重要作用。Yu等[21]從健康的人類牙齒中分離出DMP，通過體外實驗發(fā)現(xiàn)DMP可增強BMSCs的堿性磷酸酶活性和礦化作用，并上調成骨分化相關標志物的表達。還有學者發(fā)現(xiàn)DMP可改變成骨基因的表達[22]，對骨骼重塑和礦化的速度、OB與破骨細胞的形態(tài)和活性有重要調節(jié)作用[23]。OC與OPN也分別被報道在磷灰石晶體成核、頜骨的生長和發(fā)育[24]及牙槽骨的礦化[25]中發(fā)揮作用。VEGF是血管形成最重要的生長因子，在OB和血管內皮細胞之間起重要連接作用，可增加OB的遷移率，從而促進新骨形成。Reis-Filho等[26]用牙本質充填大鼠上頜第二磨牙拔牙創(chuàng)，結果顯示在7、14 d后VEGF表達明顯增加，并伴有新生血管與新骨生成，拔牙創(chuàng)愈合也早于僅填有血凝塊的對照組，表明牙本質可激活VEGF表達從而具有骨誘導作用。

牙本質的無機成分及Ⅰ型膠原、BMP、NCPs、VEGF等有機成分在成骨過程中發(fā)揮重要作用，但每種成分的具體作用機制及誘導骨再生的上下游信號通路尚需進一步明確。

3 牙本質骨修復材料的處理方法

牙本質中含有大量的潛在性抗原物質，如脂類、膠原蛋白、蛋白多糖等，且成牙本質細胞突起也可引起免疫排斥反應，因此在植入之前，為提高成骨活性，降低感染和免疫排斥反應等風險，需經過一定的處理，以消減牙本質的抗原性。

3.1 脫礦處理

牙本質含有大量高礦化、高結晶、低孔性的HA成分，這會產生物質屏障作用，阻止液體的浸潤，使生長因子不易釋放，干擾OB與MSCs的遷移、附著和分化，因此需去除部分礦物質以提高孔隙率從而促進成骨效果。Um[27]發(fā)現(xiàn)：脫礦后的牙本質由于孔隙增加，可作為骨組織工程學所需的生物支架，也可作為rhBMP-2的載體，促進rh-BMP-2等生長因子的釋放，從而具有骨誘導性。除此之外，脫礦可提高牙本質骨傳導性，對成骨相關細胞的增殖起促進作用。Bono等[28]將成骨細胞樣細胞接種至脫礦牙本質材料表面，觀察到明顯的細胞黏附、增殖與分化。Koga等[4]還發(fā)現(xiàn)，相較于未脫礦質牙本質及完全脫礦牙本質，部分脫礦的牙本質基質促進OB黏附與誘導新骨形成的能力最強。因此，適當?shù)拿摰V不會破壞牙本質中天然蛋白質的構象及生長因子的活性，也不會抑制BMP骨誘導作用。相反，脫礦牙本質由于去除了無機物，HA結晶度變低，牙本質小管增寬，孔隙增加，可使BMP等生長因子的生物利用度增加，堿性磷酸酶活性增強，成骨相關細胞增殖及分化能力提升[29]，從而為新骨形成提供更好的空間支撐。這些特性使得脫礦作為處理牙本質的首選方法，被廣泛應用于牙本質骨修復材料的加工中。

3.2 煅燒處理

牙本質在煅燒后具有良好的生物相容性，可作為支架為骨組織生長提供結構支持，還可提供鈣和磷等必要的成分。郭津源等[30]將鍛燒處理的牙本質與富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）聯(lián)合使用修復兔顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)其能與自體骨形成良好骨結合，且隨著自體骨的再生逐漸被吸收，具有良好的生物相容性和成骨作用。Kim[31]將拔除的牙齒置于1 200 ℃熔爐中煅燒，然后研磨成直徑小于149 μm的牙本質顆粒，與氫氧化鈣以2∶1的質量比混合植入骨缺損處，發(fā)現(xiàn)成骨效果良好，表明煅燒處理后的牙本質具有良好的生物相容性，能與骨組織形成較強的化學結合，具有骨傳導作用。

3.3 冷凍處理

Atiya等[32]拔除新西蘭大白兔上下頜中切牙提取牙本質，于液態(tài)氮中冷凍20 min后再放置室溫下15 min，然后將其浸泡在0.2 mL慶大霉素和5 mL 70%乙醇混合液中30～60 min，隨后將其研磨成直徑2～4 mm的小顆粒植入骨缺損處，結果顯示：新生骨小梁與牙本質融合，且骨密度與空白對照組相比更高，表明液氮冷凍處理的牙本質具有骨傳導和骨誘導雙重特性。

3.4 脫蛋白處理

牙本質是致密的礦化組織，脫蛋白加工可提高其孔隙率及增大孔徑，有利于新血管形成和細胞浸潤，發(fā)揮HA等磷酸鈣的支架作用，可有效促進骨再生。Fichant等[33]對牙本質進行脫蛋白處理，掃描電子顯微鏡下觀察到材料表面出現(xiàn)由膠原纖維消失所形成的新孔隙，使牙本質表面的孔隙率增大到約20%。Tabatabaei等[34]在模擬人體液中觀察到：脫蛋白牙本質比脫礦及天然牙本質具有更高的HA晶體形成速率，且對培養(yǎng)的人牙髓干細胞表現(xiàn)出更好的細胞黏附和促分化能力。除此之外，脫蛋白可降低牙本質的彈性模量與硬度，使其與現(xiàn)有的支架材料性能更加接近。但有學者認為牙本質脫蛋白后會失去生長因子、NCPs等骨活性物質，降低骨再生作用，因此該處理方法還有待進一步研究[11]。

3.5 煮沸處理

煮沸法是基于高溫使酶失活的原理，使蛋白質變性以降低牙本質的免疫原性。Moharamzadeh等[35]將拔除的小牛牙齒制備成直徑5～10 mm的顆粒狀牙本質，放置蒸餾水中煮沸2 h，再用異丙醇脫脂2 h去除殘留物質，沖洗、烘干、消毒后植入牛的牙槽窩內，結果發(fā)現(xiàn)：煮沸處理的牙本質能促進成纖維細胞的增殖和活性，且隨著時間延長逐漸被新骨替代，具有良好的骨誘導能力，并且由于去除了抗原性物質，所以生物相容性良好。

3.6 提取NCPs

牙本質中NCPs含量豐富，可將其單獨提取后加工，得到生物活性物質，用于與其他材料的交聯(lián)、改性等。NCPs作用多樣，不僅可調控和促進OB的黏附、增殖與分化[36-37]，參與生物礦化HA成核階段[38]，引導未分化間充質細胞內的信號傳導級聯(lián)反應[39]，還可誘導人牙周膜干細胞的成骨向分化[40]。有學者[41]用溶解的DDM蛋白提取物培養(yǎng)牙髓干細胞，發(fā)現(xiàn)DDM可刺激細胞擴張，抑制凋亡標志物caspase 3的表達，上調細胞存活標志物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinases，Akt1），并促進細胞的礦化基質沉積。綜合這些研究結果可見，NCPs被提取后可作為生物活性因子搭載至支架材料，在骨組織工程學中具有廣闊的應用前景。

目前對牙本質處理采用最多的仍為脫礦處理，而對其他處理方式如煅燒、脫蛋白及煮沸處理等探討較少。未來應繼續(xù)對牙本質的加工工藝進行探索，尋找新的處理方式，以最大程度地發(fā)揮其成骨潛力[11]。

4 牙本質作為骨修復材料的臨床應用

牙本質促進骨再生能力在許多動物實驗中已得到證實[42-44]，近年來多項臨床研究[45-50]表明：牙本質作為骨替代材料在種植治療、引導骨再生、上頜竇提升、牙槽嵴提升等多項臨床治療中也取得了良好效果。Schwarz等[45]將自體牙本質片用于牙槽嵴骨增量，術后24周發(fā)現(xiàn)牙槽嵴寬度增加了4.5 mm，且種植體穩(wěn)定性良好。Melek等[46]將患者自身拔除的前牙與前磨牙制成牙本質顆粒即刻回植，術后3個月影像學觀察可見平均骨量增加23.47%，6個月后平均骨密度增加30%。一項包含38例患者的前瞻性研究[47]將牙本質用于恢復水平或垂直牙槽骨高度，結果顯示傷口愈合良好，組織學檢查可見新骨形成。Kim等[48]對DDM植入種植體周圍的5個病例隨訪5年，發(fā)現(xiàn)在種植體周圍有皮質骨及松質骨形成且維持良好；將患者自體根部牙本質制備成牙本質塊，放置于種植體周圍骨缺損部位，術后觀察44個月，22例患者中18例均未出現(xiàn)種植體周圍邊緣骨喪失[49]。Minamizato等[50]采用DDM分別進行牙槽窩保存術（7例）、牙槽嵴提升術（6例）和上頜竇底提升術（3例），隨訪結果顯示所有患者的植骨部位均愈合良好，無并發(fā)癥出現(xiàn)，表明牙本質具有良好的成骨能力與生物相容性。

與現(xiàn)有骨修復材料相比，牙本質也展現(xiàn)出相近甚至更優(yōu)的臨床療效。Kim等[51]為2組行上頜竇提升術的患者，分別同時植入牙本質顆粒與人工骨粉，1年后發(fā)現(xiàn)2組上頜竇底到牙槽嵴頂之間的骨吸收量無明顯差異。Pang等[52]將Bio-Oss骨粉和DDM分別用于拔牙位點保存并植入種植體，結果顯示：2組垂直骨增量、術后種植體穩(wěn)定性均無明顯差異。吳崢嶸等[53]對下頜第一磨牙根分叉病變患者分別使用牙本質顆粒聯(lián)合PRF及Bio-Oss骨粉作為骨修復材料，經過1、6、12個月觀察，發(fā)現(xiàn)牙本質顆粒組根分叉區(qū)骨密度優(yōu)于Bio-Oss骨粉組。還有研究[54-55]比較了自體牙本質與骨移植“金標準”自體皮質骨在骨增量中的效果，結果顯示2種材料的水平骨增量無明顯差異。

5 總結和展望

綜上，牙本質作為骨修復材料具有良好的骨誘導性、骨傳導性與生物相容性，在動物實驗與臨床應用中均表現(xiàn)出良好的成骨效果。牙本質的來源廣泛，加工簡單，成本低廉，免疫原性較低，且與臨床常用的骨修復材料成骨效果相當甚至更佳，應用前景廣闊。但目前對牙本質誘導成骨的具體機制尚不明確，且現(xiàn)有的牙本質骨修復材料需經過脫礦、消毒、研磨等一系列流程處理方可用于臨床，加工過程繁復，耗時較長，在一定程度上限制了其應用[56]。未來需進一步深入研究牙本質作為骨修復材料的成骨機制，并拓展其他處理方式，同時評估其成骨的長期效果，以期早日廣泛應用于臨床。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。