乙型肝炎病毒宮內(nèi)傳播機(jī)制研究進(jìn)展

袁里朝，曲足，白曉霞

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，目前全球有慢性HBV感染者約2.57億[1]。HBV傳播途徑有水平傳播和垂直傳播兩種方式，水平傳播包括共用針頭、無保護(hù)性行為及輸入HBV感染血制品；垂直傳播即母嬰傳播，是HBV從受感染的母親到子女的傳播，母嬰傳播占慢性HBV感染的50%以上。90%以上的圍生期或嬰幼兒期HBV感染者會(huì)發(fā)展為慢性攜帶者，且發(fā)展為肝硬化和（或）肝癌的比例較高。HBV母嬰傳播可發(fā)生在妊娠期、分娩期或產(chǎn)后，大多數(shù)HBV母嬰傳播發(fā)生在分娩期。研究表明，盡管通過出生后及時(shí)注射乙型肝炎疫苗（乙肝疫苗）和乙型肝炎免疫球蛋白（hepatitis B immunoglobulin，HBIG）進(jìn)行聯(lián)合免疫，但仍有1%～9%的血清乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）和（或）HBV-DNA陽性孕婦所生嬰幼兒因?qū)m內(nèi)傳播致聯(lián)合免疫失敗而發(fā)生HBV慢性感染[2-3]。

目前HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制尚不清楚，消除HBV母嬰傳播任重道遠(yuǎn)。理論上，HBV宮內(nèi)傳播可能發(fā)生在任何階段，如HBV可能始于配子感染，或通過胎盤屏障破壞滲漏的母血感染，通過感染的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）或直接穿越胎盤屏障各細(xì)胞層感染。最近研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胎盤細(xì)胞感染可能是HBV宮內(nèi)感染主要途徑[4]。本文主要對(duì)HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 HBV母嬰傳播

眾所周知，中國是亞洲地區(qū)HBV的高流行區(qū)，近年通過全民接種乙肝疫苗、對(duì)HBV感染孕婦所生新生兒進(jìn)行乙肝疫苗和HBIG聯(lián)合免疫接種，中國正穩(wěn)步消除HBV慢性感染，1～29歲HBV慢性感染者明顯下降，從1997年的10.13%下降到2014年的2.64%[5]。但這些措施并不能完全阻止HBV母嬰傳播，2018年中國慢性HBV感染者仍達(dá)8 000萬以上[6]。90%的圍生期HBV感染者（圍生期感染的胎兒和嬰兒）將發(fā)展為慢性HBV感染，而成年HBV感染者中僅有5%～10%發(fā)展為慢性感染[7]。

母嬰傳播包括宮內(nèi)、產(chǎn)時(shí)和嬰幼兒期的傳播。產(chǎn)前傳播即宮內(nèi)感染，至今宮內(nèi)感染的機(jī)制尚不明確，目前有多種假說，機(jī)制較為復(fù)雜。經(jīng)陰道分娩或經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩中的器質(zhì)性損傷、母體和胎兒血液的微輸血、新生兒與陰道分泌物接觸等可造成HBV的產(chǎn)時(shí)傳播。產(chǎn)后傳播的本質(zhì)為水平傳播，是指嬰兒在日常生活中通過母乳喂養(yǎng)和其他親密接觸而引起的HBV感染。HBV母嬰傳播診斷標(biāo)準(zhǔn)有不同報(bào)道：①出生后嬰兒血清乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性或HBV-DNA陽性[3,8-10]；②出生后嬰兒血清HBsAg陽性或HBV-DNA陽性，持續(xù)＞2個(gè)月[11]；③出生后嬰兒持續(xù)血清抗乙型肝炎核心抗原免疫球蛋白M（anti-HBc IgM）陽性[12]；④3針乙肝疫苗接種完成1個(gè)月后嬰兒HBsAg陽性或HBVDNA陽性。不同診斷標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致報(bào)道的母嬰傳播率存在差異。高母嬰傳播率可歸因于出生后嬰兒血清HBsAg和HBV-DNA陽性僅是一過性抗原血癥的結(jié)果，通過宿主主動(dòng)和被動(dòng)免疫在8～12個(gè)月后消失[13]，目前臨床按照第4條標(biāo)準(zhǔn)診斷HBV母嬰傳播。

2 HBV宮內(nèi)傳播途徑

2.1 生殖細(xì)胞感染生殖細(xì)胞感染模型描述了在受孕時(shí)通過卵母細(xì)胞或精子感染HBV。HBV已被證明可在卵細(xì)胞內(nèi)侵襲和復(fù)制，卵母細(xì)胞內(nèi)HBV的存在和表達(dá)與母親HBV-DNA水平和感染狀態(tài)密切相關(guān)[14]。但HBV感染卵母細(xì)胞是否導(dǎo)致HBV宮內(nèi)感染目前尚無一致結(jié)論，需要更多研究證實(shí)。除了血液和肝臟，精液中也可檢測到HBV，最近研究發(fā)現(xiàn)HBV將其DNA整合到精子基因組中，可導(dǎo)致精液參數(shù)受損及男性不育[15]。這也表明HBV-DNA序列通過受感染精子傳遞到胚胎的可能性，但仍有待更多研究證實(shí)。

2.2 經(jīng)胎盤細(xì)胞感染胎盤為胎兒發(fā)育提供營養(yǎng)，同時(shí)有阻止病原體通過母胎傳播的功能[16]。從母體到胎兒，胎盤屏障由滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛間充質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞組成[17]。母血中的病原體需穿過這些細(xì)胞層感染胎兒。

研究證實(shí)胎盤組織細(xì)胞層中存在HBV。Peng等[10]發(fā)現(xiàn)胎盤組織從母體到胎兒各細(xì)胞層HBV感染率逐漸降低，蛻膜細(xì)胞中HBsAg、HBcAg和HBVDNA陽性率最高，其次是滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛間充質(zhì)細(xì)胞和絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。體外研究也證實(shí)HBV感染可穿越滋養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致母嬰傳播[4]。

2.3 經(jīng)胎盤屏障滲漏經(jīng)胎盤屏障滲漏是常見的宮內(nèi)傳播途徑。流產(chǎn)或早產(chǎn)時(shí)子宮收縮、羊水和臍帶血穿刺等侵入性手術(shù)均可使胎盤屏障破裂致母血和胎血直接交換[2,18-19]，導(dǎo)致HBV宮內(nèi)傳播。Narang等[18]總結(jié)了HBV經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移的不同機(jī)制，包括子宮收縮期間胎盤屏障破裂導(dǎo)致HBV滲漏、病毒在受感染胎盤母胎界面的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移等。一項(xiàng)納入402例HBsAg陽性母親的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，先兆早產(chǎn)與HBV宮內(nèi)傳播顯著相關(guān)（OR=5.44，95%CI：1.15～25.67，P=0.032 5）[3]。

2.4 PBMCHBV不是嚴(yán)格意義的噬肝病毒。研究已證實(shí)HBV可感染PBMC。作為HBV肝外儲(chǔ)存庫，PBMC與HBV慢性感染或HBV復(fù)發(fā)密切相關(guān)，在PBMC中檢測到多種形式的HBV-DNA[20]。研究發(fā)現(xiàn)感染HBV的PBMC可穿越胎盤作為HBV的宮內(nèi)傳播載體[8-9]。Chandran等[8]研究發(fā)現(xiàn)，83.8%的母體HBV-DNA陽性PBMC經(jīng)過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)。血清HBV-DNA陰性但PBMC HBV-DNA陽性母親所生嬰兒HBV感染風(fēng)險(xiǎn)是PBMC HBV-DNA陰性母親所生嬰兒的5倍[21]。表明HBV感染PBMC有助于其在宮內(nèi)傳播。

3 HBV感染穿越滋養(yǎng)細(xì)胞分子機(jī)制

3.1 HBV通過胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)穿越滋養(yǎng)細(xì)胞體外研究發(fā)現(xiàn)：HBV以微管依賴的胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)方式穿越體外培養(yǎng)的人胎盤來源滋養(yǎng)細(xì)胞[22]；細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞融合成合體滋養(yǎng)細(xì)胞及加入HBIG可降低HBV感染穿越滋養(yǎng)細(xì)胞的效率。加入HBIG降低HBV穿越滋養(yǎng)細(xì)胞的效率可能與細(xì)胞內(nèi)形成的HBV-IgG復(fù)合物有關(guān)[22]。該研究結(jié)果與部分學(xué)者提出的HBV宮內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)隨孕周增加而不同的結(jié)論一致[11，23]，可能與不同階段滋養(yǎng)細(xì)胞具有不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜有關(guān)。

3.2 細(xì)胞因子促進(jìn)HBV感染滋養(yǎng)細(xì)胞多種可溶性細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)胎盤生長發(fā)育在成功妊娠中起關(guān)鍵作用，如白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-3、IL-4、IL-6、γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）。胎盤微環(huán)境中這些細(xì)胞因子同時(shí)在病毒感染胎盤的細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[11]。研究表明，TNF-α可促進(jìn)HBV對(duì)絨毛膜癌細(xì)胞系（JAR和JEG-3）和初級(jí)滋養(yǎng)細(xì)胞的感染作用[24-25]。TNF-α上調(diào)體外HBV感染的JEG-3細(xì)胞中HBV-DNA和HBsAg表達(dá)及細(xì)胞外HBsAg分泌[25]。

3.3 HBV誘導(dǎo)磷脂酰肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/phospho protein kinase B，PI3K/pAKT）和Smad信號(hào)通路抑制感染滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡Cui等[26]評(píng)估了滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛膜癌細(xì)胞對(duì)HBV感染的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)HBV感染后CD133陰性的滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo細(xì)胞中Smad信號(hào)通路被激活。體外轉(zhuǎn)染致乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx蛋白）過表達(dá)的HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)同時(shí)凋亡比例明顯降低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-6和IL-10水平升高，表明細(xì)胞中pSmad2和pSmad3水平上調(diào)[27]，這種上調(diào)的炎癥反應(yīng)和增強(qiáng)的侵襲活性可能受激活的Smad信號(hào)通路調(diào)控。可見HBx蛋白可能通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖增加HBV母嬰傳播風(fēng)險(xiǎn)。與血HBV-DNA＜1×103拷貝/mL組相比，＞1×103拷貝/mL組胎盤細(xì)胞中HBx抗原（HBxAg）和PI3K表達(dá)水平較高、凋亡指數(shù)降低[28]。一項(xiàng)將表達(dá)HBx蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到JEG-3細(xì)胞的體外研究也得出相似結(jié)果[29]。說明HBV感染滋養(yǎng)細(xì)胞后通過表達(dá)HBxAg誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PI3K/pAKT和pSmad信號(hào)通路而抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而增加HBV母嬰傳播風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 HBV通過表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/AKT信號(hào)通路減少滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)EGFR/AKT信號(hào)通路的激活與HBV感染細(xì)胞有關(guān)[29]。通過質(zhì)粒pcDNA-HBx轉(zhuǎn)染和G418選擇建立穩(wěn)定表達(dá)HBx mRNA和蛋白的JEG-3-HBx菌株，表現(xiàn)出EGFR/AKT信號(hào)通路水平升高和凋亡細(xì)胞比例降低。在HBV攜帶者胎盤組織和轉(zhuǎn)染HBx基因的JEG-3細(xì)胞中都檢測到較高水平的EGFR[29]，且EGFR抑制劑吉非替尼（gefitinib）可抑制細(xì)胞中pAKT上調(diào)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。此外，HBx小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染的JEG-3-HBx細(xì)胞株中EGFR/AKT通路受到抑制并增加細(xì)胞凋亡，反向添加表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）不改變HBx蛋白表達(dá)，但部分逆轉(zhuǎn)HBx siRNA作用[29]。上述研究結(jié)果表明HBx蛋白可能通過激活EGFR/AKT信號(hào)通路減少滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，增加HBV宮內(nèi)傳播風(fēng)險(xiǎn)。

4 HBV母嬰傳播阻斷

4.1 妊娠期抗病毒治療HBV-DNA的閾值母體HBV-DNA的高病毒載量和HBeAg陽性是影響HBV母嬰傳播的重要因素。研究顯示，HBeAg陽性孕婦發(fā)生母嬰傳播的風(fēng)險(xiǎn)與分娩前HBV-DNA病毒載量呈正相關(guān)[30]。故應(yīng)用抗病毒藥物抑制HBV病毒復(fù)制、降低HBV-DNA滴度可降低圍生期HBV母嬰傳播率。當(dāng)HBV-DNA＞2×105IU/mL時(shí)，HBV母嬰傳播阻斷失敗的風(fēng)險(xiǎn)增加。歐洲肝病研究學(xué)會(huì)（European Association for the Study of the Liver，EASL）、美國肝病研究學(xué)會(huì)（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）及《阻斷乙型肝炎病毒母嬰傳播臨床管理流程（2021年）》均建議HBV-DNA＞2×105IU/mL的孕婦進(jìn)行抗病毒治療以降低HBV母嬰傳播發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[31]。在相關(guān)研究證據(jù)基礎(chǔ)上，為最大程度阻斷HBV母嬰傳播，《中國乙型肝炎病毒母嬰傳播防治指南（2019年版）》建議當(dāng)1×104IU/mL≤HBV-DNA≤2×105IU/mL時(shí)，特別對(duì)有家族史、一胎感染史者，可與患者充分溝通權(quán)衡利弊后決定是否進(jìn)行抗病毒治療[32]。目前學(xué)術(shù)界針對(duì)HBV-DNA＞2×105IU/mL的孕婦是否需要抗病毒治療的問題仍有爭議[32]，相信未來更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)將有助于明確妊娠期抗病毒治療的HBV-DNA閾值。

4.2 妊娠期抗病毒治療的時(shí)機(jī)研究表明，妊娠期抗病毒治療可降低高病毒載量孕婦母嬰傳播風(fēng)險(xiǎn)。但對(duì)于抗病毒治療時(shí)機(jī)仍有爭議。2017年EASL指南推薦在妊娠24～28周給予抗病毒治療以預(yù)防HBV母嬰傳播，AASLD和加拿大婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)則推薦在妊娠28～32周開始抗病毒治療以阻斷HBV母嬰傳播。Wu等[33]基于35項(xiàng)研究（6 738例孕婦），發(fā)現(xiàn)妊娠早、中、晚期啟動(dòng)抗病毒治療均有助于阻斷HBV母嬰傳播，與妊娠晚期相比，妊娠早、中期啟動(dòng)抗病毒治療HBV母嬰傳播率更低（RR=0.045，95%CI：0.005～0.200），妊娠28周前與妊娠28周后開始抗病毒治療相比，母體妊娠并發(fā)癥、胎兒先天異常和不良出生結(jié)局發(fā)生率無顯著差異?；谏鲜鲅芯浚堵砸倚透窝追乐沃改希?019年版）》及《中國乙型肝炎病毒母嬰傳播防治指南（2019年版）》均推薦妊娠24～28周開始抗病毒治療以降低HBV母嬰傳播發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但Jourdain等[34]研究顯示：與對(duì)照組相比（2%），妊娠28周后口服替諾福韋（tenofovir）組HBV母嬰傳播率無明顯降低（0 vs.2%，P=0.12）。但該研究樣本量少，未來需更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)加以證明。

5 結(jié)語

對(duì)HBV免疫預(yù)防措施的普及使慢性HBV感染率已顯著下降。HBV宮內(nèi)感染是引起慢性感染的最主要方式。越來越多的研究集中于HBV宮內(nèi)感染的相關(guān)機(jī)制，但研究結(jié)果尚存爭議。因此研究HBV宮內(nèi)感染機(jī)制，探索新的乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物，可為進(jìn)一步阻斷HBV母嬰傳播提供新思路，對(duì)探索更安全有效的綜合的母嬰傳播阻斷策略具有重大的臨床意義。同時(shí)妊娠期應(yīng)及時(shí)進(jìn)行HBsAg和HBeAg篩查，識(shí)別慢性HBV感染育齡期女性，定量監(jiān)測HBV-DNA和肝功能以了解母體HBV感染狀況并制定個(gè)性化抗病毒治療方案，從而達(dá)到消除HBV母嬰傳播的目的。