RF酰胺相關(guān)肽3調(diào)節(jié)雌性哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)的研究進(jìn)展

李楊，楊洪艷

在雌性哺乳動(dòng)物中，生殖衰老是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及進(jìn)行性卵巢功能障礙，是體內(nèi)狀態(tài)和體外環(huán)境綜合作用的結(jié)果，而這種綜合作用通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢（hypothalamus-pituitary-ovary，HPO）軸的神經(jīng)內(nèi)分泌因子之間的相對(duì)平衡來(lái)調(diào)控[1]，促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）被認(rèn)為是HPO軸的控制因子，在生殖中的重要性已被廣泛研究[2]。2000年日本學(xué)者在日本鵪鶉大腦中發(fā)現(xiàn)促性腺激素抑制激素（gonadotropininhibitory hormone，GnIH），證實(shí)其對(duì)HPO軸產(chǎn)生抑制調(diào)節(jié)作用[3]。緊接著該團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了GnIH同源物，命名為RF酰胺相關(guān)肽（RFamiderelated peptide，RFRP），其 由RFRP神 經(jīng) 元 分 泌，RFRP基因編碼2條有生物活性的短肽——RFRP-1和RFRP-3，但只有RFRP-3具有生化特征[4]。近5年研究人員主要對(duì)RFRP-3在人類(lèi)、羊、大鼠和小鼠等哺乳動(dòng)物下丘腦中的分布和功能進(jìn)行了一定的研究。

下丘腦中RFRP-3神經(jīng)元的分布在不同物種間略有不同，但幾乎所有研究都表明下丘腦背內(nèi)側(cè)核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMH）是RFRP-3神經(jīng)元聚集的關(guān)鍵區(qū)域，通過(guò)受體藥理特性的系統(tǒng)比較研究以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中結(jié)合親和力和有效性的研究表明，G蛋白耦聯(lián)受體147（G protein-coupled receptor 147，GPR147）是RFRP-3的功能性受體[5]。RFRP-3對(duì)生殖的影響似乎并不清晰，歸因于物種、環(huán)境條件和實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段不同，以及不同的藥物濃度和作用位點(diǎn)（中樞或者外周）[6]。本文重點(diǎn)介紹RFRP-3在雌性哺乳動(dòng)物生殖調(diào)節(jié)、能量平衡和應(yīng)激調(diào)節(jié)3個(gè)方面的重要研究進(jìn)展。

1 RFRP-3對(duì)女性生殖發(fā)育的調(diào)節(jié)作用

1.1 RFRP-3對(duì)下丘腦-垂體性腺軸的調(diào)節(jié)作用其通常直接或間接抑制哺乳動(dòng)物GnRH/黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）的合成和分泌。一方面，RFRP-3神經(jīng)纖維與GnRH神經(jīng)元突起周?chē)o密接觸，且1/3的GnRH神經(jīng)元細(xì)胞體表達(dá)GPR147，表明RFRP-3對(duì)GnRH系統(tǒng)有直接作用。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，RFRP-3對(duì)40%的GnRH神經(jīng)元放電頻率具有快速、可重復(fù)的抑制作用，進(jìn)而抑制LH分泌[7]。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)RFRP-3神經(jīng)元的投射與小鼠、綿羊和猴子的Kisspeptin神經(jīng)元形成密切的聯(lián)系，其中在小鼠的弓狀核（arcuate nucleus，ARC）約有25%的Kisspeptin神經(jīng)元表達(dá)GPR147[8]，表明RFRP-3還可能通過(guò)Kisspeptin抑制GnRH的活性。Zmijewska團(tuán)隊(duì)的2項(xiàng)研究表明，RFRP-3通過(guò)Kisspeptin影響動(dòng)情周期內(nèi)豬垂體細(xì)胞LH及卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的合成和分泌[9-10]。除了對(duì)GnRH神經(jīng)元的作用外，RFRP-3還可能直接通過(guò)垂體改變促性腺激素的合成和分泌，研究表明，RFRP-3可直接作用于大鼠垂體，抑制促性腺激素的釋放[7]。RFRP-3對(duì)循環(huán)排卵時(shí)LH峰的抑制似乎不通過(guò)GnRH系統(tǒng)發(fā)揮作用，因?yàn)樵趦?nèi)側(cè)視前區(qū)GnRH和RFRP-3受體GPR147 mRNA的表達(dá)無(wú)差異，推測(cè)RFRP-3可能直接影響垂體促性腺激素細(xì)胞[11]。綜上，RFRP-3至少存在3條調(diào)控雌性哺乳動(dòng)物L(fēng)H分泌的途徑，即RFRP-3-Kisspeptin-GnRH-LH、RFRP-3-GnRH-LH和RFRP-3-LH。當(dāng)然，性別差異也可能使得以上3種作用途徑在雄性哺乳動(dòng)物體內(nèi)不完全一致。

1.2 RFRP-3在青春期生殖系統(tǒng)發(fā)育中的作用哺乳動(dòng)物從出生到生命結(jié)束均受到神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控，而青春期受生殖神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控尤為明顯，這是一個(gè)復(fù)雜而有組織的過(guò)程。當(dāng)前研究證實(shí)，青春期是通過(guò)高頻GnRH脈沖來(lái)調(diào)節(jié)的，而作為GnRH上游的一種抑制因子，RFRP-3抑制青春期前哺乳動(dòng)物促性腺激素分泌。然而，RFRP-3是如何調(diào)節(jié)青春期前哺乳動(dòng)物GnRH分泌的？2012年Losa-Ward等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙酚A誘導(dǎo)的青春期早熟大鼠腦內(nèi)RFRP-3的纖維密度降低，其與GnRH神經(jīng)元的接觸減少，從而對(duì)GnRH神經(jīng)元的抑制作用減弱，出現(xiàn)性早熟癥狀。而2014年發(fā)表的2項(xiàng)研究表明，編碼人類(lèi)RFRP-3和GPR147的基因發(fā)生變異與GnRH依賴(lài)型青春期疾病的發(fā)生無(wú)關(guān)，同時(shí)GPR147基因敲除小鼠的青春期啟動(dòng)時(shí)間沒(méi)有改變[13-14]。2015年Semaan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在青春期前期，DMH中RFRP-3的表達(dá)和RFRP-3/c-fos的共表達(dá)均顯著降低，這可能導(dǎo)致在青春期早期RFRP-3對(duì)GnRH神經(jīng)元的抑制減少。另外，2017年Han等[16]研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射RFRP-3可明顯延緩幼年雌性大鼠的青春期啟動(dòng)，表現(xiàn)為血清LH和雌二醇（estradiol，E2）水平顯著降低、子宮成熟延遲、陰道口開(kāi)放時(shí)間推遲和血清生長(zhǎng)激素水平升高。2020年Si等[17]的研究提示，青春期啟動(dòng)延遲，與γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)元受到抑制引起RFRP-3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化有關(guān)。但RFRP-3控制青春期的GnRH分泌機(jī)制及相關(guān)神經(jīng)肽的作用和特性仍然有待深入研究。

1.3 RFRP-3在卵巢相關(guān)疾病中的作用在雌性哺乳動(dòng)物中，生殖衰老是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，與HPO軸的中樞控制改變和晝夜節(jié)律系統(tǒng)的去同步化有關(guān)，涉及漸進(jìn)性卵巢功能障礙。卵巢是卵子成熟及卵母細(xì)胞分化和釋放的場(chǎng)所，卵巢內(nèi)產(chǎn)生的類(lèi)固醇從青春期發(fā)育到排卵和生殖周期的過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。生殖失調(diào)在生殖激素表現(xiàn)為抗苗勒管激素和雌激素水平降低、促性腺激素和雄激素水平升高等，臨床表現(xiàn)為早發(fā)性卵巢功能不全、多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）及卵泡成熟障礙導(dǎo)致的排卵障礙和不孕癥等。

早發(fā)性卵巢功能不全與GnRH脈沖釋放減少和HPO軸下游受損有關(guān)。然而，觸發(fā)這一轉(zhuǎn)變的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制尚未闡明。Geraghty等[18]研究了不同程度生殖衰退的中年雌性大鼠（包括周期正常、周期不規(guī)則和周期完全停止），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在卵巢周期出現(xiàn)任何變化之前，大鼠大腦中的激素水平已經(jīng)發(fā)生變化。在動(dòng)情周期發(fā)生改變之前，大鼠下丘腦中RFRP-3 mRNA表達(dá)增加，但這種增加是短暫的，隨之而來(lái)的是Kisspeptin和GnRH mRNA表達(dá)的下降。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，RFRP-3及其受體GPR147在卵巢中的表達(dá)也局部增強(qiáng)，提示卵巢衰老可能是由GnRH系統(tǒng)上游的RFRP-3調(diào)節(jié)神經(jīng)肽網(wǎng)絡(luò)的改變引發(fā)的。此外，RFRP-3和GPR147在小鼠動(dòng)情前期和動(dòng)情期的卵巢顆粒細(xì)胞、有腔卵泡以及動(dòng)情間期的黃體細(xì)胞中合成，提示它們參與了卵泡的發(fā)育和閉鎖；在人卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，RFRP-3可抑制促性腺激素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）積累和孕酮分泌[19]。以上結(jié)果表明，RFRP-3對(duì)卵巢發(fā)育起負(fù)向調(diào)控作用，且其表達(dá)水平會(huì)隨年齡的變化而變化。

PCOS以高雄激素血癥和排卵功能障礙為顯著特征，與生殖、內(nèi)分泌、心理和代謝紊亂緊密相關(guān)。已有研究顯示，恒定光照誘導(dǎo)的PCOS大鼠DMH中RFRP-3基因表達(dá)降低，提示PCOS發(fā)病過(guò)程中RFRP-3基因表達(dá)降低可能導(dǎo)致其對(duì)GnRH的抑制作用弱化[20]。并且在注射睪酮建立的大鼠PCOS模型中，其下丘腦RFRP-3 mRNA表達(dá)減少[21]。因此筆者推測(cè)，RFRP-3參與調(diào)控PCOS疾病過(guò)程中類(lèi)固醇激素合成分泌乃至卵巢多囊樣改變的進(jìn)程。基于RFRP-3對(duì)雌性HPO軸功能的影響，其他卵巢常見(jiàn)疾病諸如卵巢癌、卵巢囊腫等與RFRP-3及其受體的表達(dá)改變是否有關(guān)也是一個(gè)值得思考及研究的問(wèn)題。

2 RFRP-3參與能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)

生殖對(duì)生物體能量?jī)?chǔ)備和新陳代謝狀態(tài)的變化高度敏感，生殖能力缺陷往往與不利的能量穩(wěn)態(tài)條件有關(guān)，在此背景下，關(guān)于RFRP-3系統(tǒng)對(duì)生殖功能影響的研究擴(kuò)展到其在調(diào)節(jié)食欲及能量方面的潛在作用[22]。研究也顯示，RFRP-3及其受體GPR147不僅分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也分布于胃腸道、卵巢和胰腺等外周器官中[23]。

RFRP-3是生殖和能量平衡之間的中介，在食物受限的青春期前期母羊卵巢發(fā)育過(guò)程中，限食顯著抑制了卵巢發(fā)育和卵泡生長(zhǎng)，RFRP-3 mRNA表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明RFRP-3可能參與能量及卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)。側(cè)腦室注射RFRP-3可顯著增加雄性大鼠和綿羊的攝食量，提示內(nèi)源性RFRP-3具有一定的促食欲作用[24]。電生理研究表明，RFRP-3抑制小鼠厭食神經(jīng)元（如POMC），并減弱Kisspeptin對(duì)POMC神經(jīng)元的興奮作用，發(fā)揮促進(jìn)攝食的作用[25]。但是，Kovács等[26]得出不同結(jié)論，該研究首次發(fā)現(xiàn)在大鼠杏仁核內(nèi)微量注射RFRP-3顯示出厭食特性。杏仁核的中央核區(qū)參與攝食和體質(zhì)量的調(diào)節(jié)，其內(nèi)注射50 ng和100 ng RFRP-3可導(dǎo)致大鼠攝食量顯著減少?？梢?jiàn)RFRP-3在靜脈注射或顯微注射到大腦不同部位時(shí)可導(dǎo)致不同的狀態(tài)，中樞和外周注射RFRP-3對(duì)攝食量影響的確切機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究。

RFRP-3作為一種新的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，還參與血糖動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。在一項(xiàng)RFRP-3對(duì)大鼠攝食量、膳食結(jié)構(gòu)和體質(zhì)量影響的研究中發(fā)現(xiàn)，腹腔注射RFRP-3可引起大鼠體質(zhì)量明顯增加、進(jìn)食量增加、葡萄糖耐受不良、胰島細(xì)胞增大以及胰島炎性反應(yīng)顯著增加；免疫熒光雙染數(shù)據(jù)顯示，在胰島中，RFRP-3主要與胰高血糖素共定位，而GPR147主要與胰島素共定位，提示RFRP-3可能通過(guò)GPR147在大鼠胰島β細(xì)胞上以自分泌和（或）旁分泌的方式發(fā)揮作用，從而抑制胰島素的產(chǎn)生；此外，長(zhǎng)期腹腔注射RFRP-3的大鼠在接受外源性葡萄糖14 d后，血糖水平也顯著升高，提示腹腔注射RFRP-3不僅能誘導(dǎo)高血糖，而且能鈍化大鼠對(duì)外源性葡萄糖的敏感性，降低糖清除反應(yīng)[24]。筆者認(rèn)為腹腔注射RFRP-3可能通過(guò)其受體調(diào)節(jié)外周激素（胰島素和胰高血糖素）作用于外周內(nèi)分泌腺體及細(xì)胞，從而為下丘腦相關(guān)的攝食反饋機(jī)制提供外周反饋信號(hào)，但是外周RFRP-3能否像其他外周激素一樣通過(guò)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦尚不清楚。

3 RFRP-3參與生殖應(yīng)激反應(yīng)

長(zhǎng)期高度的焦慮和心理壓力可能會(huì)導(dǎo)致女性生育能力受損。即使在應(yīng)激源消失后，女性生殖功能受損的負(fù)面影響也不能完全恢復(fù)，目前還缺乏一個(gè)分子框架來(lái)理解壓力等應(yīng)激反應(yīng)對(duì)女性生殖的長(zhǎng)期影響。

應(yīng)激抑制促性腺激素的釋放已經(jīng)在魚(yú)、鳥(niǎo)、嚙齒動(dòng)物、家畜和人類(lèi)中被證實(shí)。這主要是通過(guò)抑制GnRH和GnRH受體的合成，干擾垂體LH的釋放，以及增強(qiáng)GnIH/RFRP-3神經(jīng)元的功能來(lái)發(fā)揮作用[27]。小鼠和大鼠的束縛應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦RFRP-3表達(dá)增加，并伴隨循環(huán)皮質(zhì)酮水平的升高和HPO軸功能的降低；而下調(diào)下丘腦RFRP-3基因表達(dá)可以防止慢性應(yīng)激導(dǎo)致的不孕和早期妊娠丟失，增加妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)[28]。以上均說(shuō)明RFRP-3參與了應(yīng)激誘導(dǎo)的生殖效應(yīng)整合。

Geraghty等[29]探討了壓力應(yīng)激導(dǎo)致雌性大鼠出現(xiàn)持久生育問(wèn)題的機(jī)制，每天限制大鼠活動(dòng)3 h，共持續(xù)18 d，然后讓大鼠恢復(fù)一個(gè)完整的生殖周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的激素水平恢復(fù)到正常，但大腦中的RFRP-3水平仍然很高，并且在生殖周期恢復(fù)之后，也不太可能交配；即使出現(xiàn)交配，雌性大鼠懷孕概率也降低[限制活動(dòng)大鼠的繁殖成功率（僅21%）顯著低于非應(yīng)激大鼠（76%）]。該研究進(jìn)一步利用巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的病毒載體沉默雌性大鼠的RFRP-3表達(dá)，降低RFRP-3蛋白水平，結(jié)果顯示雌性大鼠的交配、懷孕和胚胎存活率恢復(fù)到與非應(yīng)激大鼠相似的正常水平。以上結(jié)果提示，應(yīng)激期間RFRP-3水平的升高可能會(huì)對(duì)生育產(chǎn)生持久的負(fù)面影響。

另外，研究推測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)的RFRP-3升高可能作用于影響交配和懷孕的神經(jīng)回路，而不依賴(lài)于性激素[30]。注射RFRP-3可導(dǎo)致倉(cāng)鼠大腦中與性沖動(dòng)有關(guān)區(qū)域的細(xì)胞激活，包括視前內(nèi)側(cè)核、內(nèi)側(cè)杏仁核和終紋床核等所有接受RFRP-3投射的區(qū)域，這些效應(yīng)獨(dú)立于性腺類(lèi)固醇和Kisspeptin細(xì)胞激活。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

基于RFRP-3的重要神經(jīng)內(nèi)分泌作用及不同物種研究結(jié)果的差異性，在今后研究中，以下幾個(gè)方面值得考慮。①RFRP-3在神經(jīng)內(nèi)分泌作用過(guò)程中的性別差異。雖然大腦內(nèi)RFRP-3神經(jīng)元形態(tài)及分布的性別差異尚不明顯，但RFRP-3及其受體GPR147似乎在性別之間經(jīng)歷了不同的發(fā)育變化，在參與女性動(dòng)情、哺乳、月經(jīng)周期和妊娠等眾多過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與男性不同[31]。②E2負(fù)反饋對(duì)RFRP-3神經(jīng)元作用的爭(zhēng)議。類(lèi)似于Kisspeptin神經(jīng)元，RFRP-3神經(jīng)元可能是E2反饋的中樞位點(diǎn)。然而，在不同物種、性別和條件下得到的結(jié)果是相互矛盾的。有研究顯示E2處理可增加大鼠下丘腦細(xì)胞系中RFRP-3的合成[32]，另有研究顯示E2處理降低了雄性和雌性小鼠RFRP-3神經(jīng)元胞體內(nèi)RFRP-3 mRNA的表達(dá)水平[31]。對(duì)雌性大鼠及雌性敘利亞倉(cāng)鼠的研究表明，性腺切除后無(wú)論是否采用性激素替代對(duì)RFRP-3的合成都沒(méi)有顯著影響[33]。推測(cè)可能原因?yàn)椋寒?dāng)基礎(chǔ)E2濃度較低時(shí)，E2可能會(huì)在青春期前刺激RFRP-3 mRNA表達(dá)；而當(dāng)基礎(chǔ)E2濃度較高時(shí)，E2可能會(huì)抑制成體發(fā)情期RFRP-3 mRNA的表達(dá)?？傊?，RFRP-3的表達(dá)可能受E2的調(diào)節(jié)，但不同物種在E2調(diào)節(jié)RFRP-3的方式上可能存在差異，需要更多研究進(jìn)一步闡明。③RFRP-3調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素合成。已經(jīng)證明，RFRP-3參與哺乳動(dòng)物性腺類(lèi)固醇生成的調(diào)節(jié)。然而RFRP-3調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素合成的研究很少，其分子機(jī)制不清，深入研究神經(jīng)肽對(duì)神經(jīng)類(lèi)固醇合成的調(diào)節(jié)，可能會(huì)極大地影響HPO軸的概念以及類(lèi)固醇激素對(duì)下丘腦和垂體的反饋機(jī)制。

關(guān)于RFRP-3的研究應(yīng)當(dāng)圍繞將基礎(chǔ)研究向醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化開(kāi)展，例如RFRP-3或其拮抗劑可以作為替代或輔助治療藥物來(lái)治療應(yīng)激、厭食和肥胖。RFRP-3作為促性腺激素分泌的內(nèi)源性抑制劑，顯示出其在治療卵巢疾病、神經(jīng)性生殖功能障礙相關(guān)疾病及性早熟、子宮內(nèi)膜異位癥等類(lèi)固醇激素依賴(lài)性疾病方面的潛力。