十字花科蔬菜小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

牛劉靜 趙艷艷 原玉香 魏小春 楊雙娟 王志勇 蘇賀楠張曉偉* 尹喜恩

（1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南鄭州 450008；2 鄢陵縣甘羅養(yǎng)生養(yǎng)老有限公司，河南鄢陵 461200）

十字花科（Brassicaceae）植物約有375 屬、3 200 種，廣布于全世界，主產(chǎn)北溫帶，在我國共有95 屬、425 種、124 變種和9 個變型（張振超，2012）。在眾多的十字花科植物中，蕓薹屬和蘿卜屬包含了主要的蔬菜作物，在整個科中都占有極大的比重，社會需求量大，經(jīng)濟價值高，與人們生活有著密不可分的聯(lián)系。

十字花科蔬菜常規(guī)育種方法存在育種年限長，過程繁瑣費力，遺傳性狀不穩(wěn)定等問題。小孢子培養(yǎng)技術(shù)是十字花科蔬菜常規(guī)育種途徑的“加速版”，得到的純合再生植株可以直接作為親本使用，縮短育種進(jìn)程，提高了培育新品種的效率。自1982年Lichter 首次在甘藍(lán)型油菜上報道獲得了小孢子再生植株后，此技術(shù)在十字花科蔬菜中均有大量報道（Hoseini et al.，2014；吳藝飛 等，2016；Bhatia et al.，2016；鄧英 等，2018；賈凱 等，2018；蘇賀楠 等，2018；Jia et al.，2019），且在基礎(chǔ)應(yīng)用研究中也獲得了利用。育種家們利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)陸續(xù)在大白菜、甘藍(lán)、青花菜、花椰菜等國內(nèi)消費市場占比較大的蔬菜上培育出多個新品種，大大加快了我國十字花科蔬菜品種的更新?lián)Q代。隨著小孢子培養(yǎng)技術(shù)在十字花科大宗蔬菜作物上取得的顯著成果，以及市場生產(chǎn)和消費群體對多品種、高質(zhì)量葉菜類蔬菜的需求，學(xué)者們對一些名優(yōu)特蔬菜也進(jìn)行了深入的小孢子培養(yǎng)研究和報道，比如高菜（張琳 等，2011）、安徽烏菜（秦艷梅 等，2017）、廣州菜心（龐強強 等，2021）等。

提高小孢子培養(yǎng)效率，獲得更多類型的DH系，可為十字花科蔬菜分子標(biāo)記育種、遺傳學(xué)研究、應(yīng)用基礎(chǔ)研究等提供堅實的材料基礎(chǔ)。近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者在如何提高誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生形成胚，胚芽健康生長成幼苗繼而獲得可利用的單倍體再生植株及應(yīng)用研究等方面做了大量工作。為了使小孢子培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢利用率最大化，本文就國內(nèi)外十字花科蔬菜近些年來小孢子培養(yǎng)取得的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 基因型和小孢子發(fā)育時期對小孢子誘導(dǎo)成胚的影響

1.1 基因型

基因型是影響小孢子胚胎發(fā)生的主要內(nèi)因，不同基因型材料間成胚能力差異明顯（Chuong et al.，1988；Ballie et al.，1992）。在研究報道最多的白菜類蔬菜中，大白菜（李必元 等，2012）、微型大白菜（盧松 等，2015）和普通白菜（黃天虹等，2019）不同基因型供試材料雖然都獲得了胚狀體，但胚誘導(dǎo)率差異顯著。陳麗瀟等（2019）和付丹丹（2019）均研究發(fā)現(xiàn)，抗根腫病大白菜受試材基因型的影響難以出胚或者胚誘導(dǎo)能力低。Bhatia等（2016）研究表明，在花椰菜上小孢子誘導(dǎo)成胚的數(shù)量和發(fā)生能力與成熟期不同的基因型材料密切相關(guān)，晚熟材料Kt-34 產(chǎn)胚量最高（24.9 胚·皿-1）。姚悅梅等（2019）在羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，出胚多的基因型材料最后小孢子發(fā)育成子葉型胚的比例也高；而出胚量少的材料形成畸形胚數(shù)量多，子葉型胚數(shù)量減少。Daria 等（2020）研究證實，蕪菁的小孢子胚胎發(fā)生能力同樣在很大程度上依賴于基因型，并且在初期胚胎啟動發(fā)生過程中次生胚的產(chǎn)生數(shù)量會直接影響雙單倍體植株的數(shù)量。在蘿卜小孢子培養(yǎng)上，張麗等（2020）對2 份水果蘿卜（肉色血紅）進(jìn)行小孢子誘導(dǎo)，成胚率分別為15.6%和21.3%。

對于出胚率低或不能獲得胚狀體的材料，學(xué)者們也一直在嘗試新的解決辦法來降低基因型的受限程度。利用種間雜交種進(jìn)行小孢子培養(yǎng)來克服此難題是目前報道較多的途徑（李栒 等，2003；李勤菲，2010；Zeng et al.，2015）。賈俊香（2019）以普通白菜（青梗菜）和菜薹（菜心）雜交F1為試材獲得了203 份多頭、葉色油亮的純合菜心材料；利用紫葉青梗菜和菜心雜交，得到122 份紫葉菜心DH材料，在改善菜心出胚率低的基礎(chǔ)上，還創(chuàng)制出新的育種親本材料。此外，李楠（2018）將不易出胚的甘藍(lán)材料小孢子置于適量的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行單花蕾懸浮培養(yǎng)，可經(jīng)游離小孢子胚發(fā)育途徑發(fā)育成胚，最高可達(dá)10 胚·蕾-1，表明此誘導(dǎo)成胚途徑具有可行性。綜上可知，十字花科蔬菜作物不同類型試材間幾乎都受到基因型的影響?；蛐筒粌H影響胚胎發(fā)生的效率，而且也影響胚狀體的質(zhì)量（Chuong et al.，1988）。

1.2 小孢子發(fā)育時期

供體植株的栽培方式、生長環(huán)境、花蕾大小、取材時期和部位等都會影響小孢子生理狀態(tài)。而胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量在一定程度上與不同發(fā)育時期的小孢子狀態(tài)是密不可分的。通常小孢子發(fā)育時期分為四分體、單核早期、單核中期、單核靠邊期、雙核期和三核期。前人研究表明，胚胎發(fā)生的啟動大部分都處于單核靠邊期和雙核期這一短暫過程中，又被稱為胚狀體發(fā)生的窗口期（余鳳群，1994；姜立榮 等，1996）。

準(zhǔn)確、快速選擇出適宜的試材培養(yǎng)時期，可減少小孢子培養(yǎng)前期的工作量，保證試驗材料在小孢子培養(yǎng)過程中的產(chǎn)胚有效性。唐兵等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大白菜花蕾中單核靠邊期的小孢子占比低于50%時，幾乎不能誘導(dǎo)出胚芽，而高于80%時產(chǎn)胚量大幅度提高，最高為77.20 胚·蕾-1；且盛花期是小孢子胚誘導(dǎo)的最佳時期。蘇賀楠等（2018）研究表明，當(dāng)結(jié)球甘藍(lán)的花蕾長度為3.0～3.5 mm、花藥長∶花瓣長為2/1～3/2 時，處于單核靠邊期的小孢子占比為67%～71%，有利于小孢子誘導(dǎo)出胚；初花期和盛花期均是進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的適宜取材時期。在蘿卜（李丹 等，2008）、青花菜（王春麗 等，2010）、新疆蕪菁（賈凱 等，2018）、烏塌菜（黃心烏）（郭靖，2019）、菜薹（菜心）（龐強強 等，2019）和普通白菜（小白菜）（楊延紅 等，2020）上的研究均得出單核靠邊期為小孢子培養(yǎng)的適宜取材時期。雖然小孢子發(fā)育時期可以參考花蕾大小、花瓣長與花藥長比值等指標(biāo)來判斷，但也會隨供體植株的基因型、栽培環(huán)境條件、株齡和花序生長等因素的變化而有所改變（張振超，2012）。

2 影響小孢子胚狀體誘導(dǎo)成功的外因

2.1 培養(yǎng)基蔗糖濃度

培養(yǎng)基成分對組織培養(yǎng)試驗而言，在很大程度上是決定能否誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)成分蔗糖具有提供必需營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的雙重作用。通常十字花科蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)使用的蔗糖濃度為13%，也有少數(shù)研究認(rèn)為高于或低于此濃度時也能誘導(dǎo)出胚芽，且在培養(yǎng)過程中不同時期更換蔗糖濃度對某些基因型材料而言出胚效果更佳（Shumilina et al.，2015；付丹丹，2019；楊易等，2020）。在蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)中，培養(yǎng)基蔗糖的使用濃度因材料基因型而異，采用適宜的濃度往往能獲得良好的試驗結(jié)果。

2.2 培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑

許多研究均表明，6-BA、NAA 和2，4-D 等在十字花科蕓薹屬蔬菜小孢子誘導(dǎo)成胚及胚狀體順利生長為再生苗，至最終形成健壯雙單倍體植株培養(yǎng)中都具有重要作用。趙艷艷等（2020）研究表明，添加0.05 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA 可顯著提高菜薹（菜心）出胚率。李智軍等（2021）研究表明，2，4-D 對芥藍(lán)小孢子成胚率的影響因基因型而異；使用不同濃度的2，4-D 會產(chǎn)生不同類型的胚狀體如子葉胚、球形胚和魚雷胚等，直接影響胚狀體的數(shù)量和質(zhì)量；添加2，4-D 對芥藍(lán)品種順寶2 號的小孢子啟動分裂無顯著影響，但可維持或提高已分裂細(xì)胞的再分裂能力，降低中途退化或敗育概率，從而提高胚產(chǎn)量。

2.3 其他添加物的應(yīng)用

汪維紅等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，使用0.2%正丁醇預(yù)處理5 h 可顯著提高烏塌菜（黃心烏）的出胚率。付丹丹（2019）研究表明，在培養(yǎng)基中添加150 mg·L-1或200 mg·L-1NaCl 顯著提高了抗根腫病大白菜的胚誘導(dǎo)率。培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1AG（阿拉伯半乳聚糖）和10 mg·L-1AGP（阿拉伯半乳糖蛋白）可顯著提高耐抽薹大白菜、普通白菜（王愛杰，2012）和結(jié)球甘藍(lán)（曾愛松 等，2015）胚芽誘導(dǎo)率。在NLN 液體培養(yǎng)基中添加0.1～0.2 mg·L-1BR 可使普通白菜胚誘導(dǎo)率提高2.05～6.39 倍（Jia et al.，2019）。頭孢噻胯對普通白菜的胚誘導(dǎo)率因基因型不同而有所差異，促進(jìn)或抑制作用因不同試材而反應(yīng)不同（黃天虹 等，2019）。

有學(xué)者還在小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加一些酸性物質(zhì)來提高難出胚材料的胚誘導(dǎo)發(fā)生能力。Yuan等（2012）研究表明，添加適量濃度的2-嗎啉乙磺酸（MES）對結(jié)球甘藍(lán)胚誘導(dǎo)率有提高效果；在pH 值為6.4 的NLN-13 培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1AGP 和3 mmol·L-1MES，出胚數(shù)量可達(dá)到4.57～222.97 胚·蕾-1，尤其是對難出胚材料中甘8號而言，胚誘導(dǎo)率提高了約35 倍。脫落酸、茉莉酸、水楊酸（Ahmadi et al.，2014）和抗壞血酸（Hoseini et al.，2014）對甘藍(lán)型油菜的小孢子胚誘導(dǎo)也起著積極作用。此外，Gao 等（2020）研究表明，非離子表面活性劑對不易誘導(dǎo)成功的紫菜薹小孢子胚狀體誘導(dǎo)和植株再生均有顯著的促進(jìn)作用。

3 胚芽轉(zhuǎn)化成苗的影響因素

3.1 瓊脂濃度

在獲得一定數(shù)量的胚狀體后，如何保證胚芽生長發(fā)育成為健康可利用的再生植株是小孢子培養(yǎng)技術(shù)中的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。繼代培養(yǎng)基中的瓊脂濃度和培養(yǎng)基含水量均會直接影響胚芽的生長情況，水分多、濕度大會導(dǎo)致再生植株出現(xiàn)玻璃化或者褐化現(xiàn)象。Peng 等（1994）發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加1.6%瓊脂時所產(chǎn)生的壓強是3～4 kPa，最有利于小孢子向胚芽途徑生長轉(zhuǎn)化，表明培養(yǎng)基中的滲透壓加快了胚芽轉(zhuǎn)化成苗的進(jìn)程。之后，Takahashi 等（2012）在白菜類作物5 個亞種上的試驗結(jié)果表明，與0.8%瓊脂濃度相比，B5 培養(yǎng)基中使用1.6%瓊脂可使胚芽轉(zhuǎn)化再生植株的能力提高4～8 倍。但是不同種類的十字花科蔬菜作物所需的壓強不同。龐強強等（2021）在菜薹（菜心）小孢子胚再生體系優(yōu)化研究中得出，B5 培養(yǎng)基中瓊脂濃度為1.0%時出苗率最高。姚悅梅等（2019）研究表明，1.2%瓊脂濃度的B5 培養(yǎng)基更有利于羽衣甘藍(lán)子葉型胚狀體的增殖分化成苗。

3.2 胚齡

胚齡是指小孢子及胚狀體在液體培養(yǎng)基中生長的天數(shù)（劉環(huán)環(huán)，2014）。將適宜胚齡的胚狀體轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基中生長發(fā)育對保證胚狀體的直接成苗率至關(guān)重要。不同蕓薹屬蔬菜作物對胚齡的要求有所差異。在菜薹（菜心）（龐強強 等，2021）和羽衣甘藍(lán)（戴希剛 等，2013）上，25～30 d 是小孢子胚再生成苗適宜的胚齡，胚齡40 d 以上的基本不出苗。對于青花菜和結(jié)球甘藍(lán)而言，較長的胚齡（30～35 d）能使胚狀體再生成苗率顯著提高，可達(dá)75%以上（王濤濤 等，2009）。胚齡為25 d的新疆蕪菁小孢子子葉型胚轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基后成活率最高，可達(dá)66.67%（賈凱 等，2018）。紅菜薹小孢子培養(yǎng)中轉(zhuǎn)接胚齡控制在15～25 d 時，成苗率為65%～83%（吳藝飛 等，2016）；但也有學(xué)者得出紅菜薹胚狀體再生成苗的最適胚齡是20～29 d（王濤濤 等，2009）。綜上可知，隨著胚齡的不斷增長，胚狀體的成活率和成苗率均會逐漸降低。

4 小孢子再生植株的倍性鑒定和加倍方式

4.1 倍性鑒定方法

王濤濤等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，在多種十字花科蕓薹屬蔬菜作物中均存在不同比例的單倍體、二倍體、多倍體及嵌合體混合再生植株?？焖勹b定出小孢子再生植株的倍性水平有助于提高DH 系材料的利用率，也是小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究的重要部分，且對于育種工作效率和實際應(yīng)用生產(chǎn)更是尤為重要。傳統(tǒng)的倍性鑒定方法主要有植株形態(tài)法（包括植株長勢、葉色葉形、花器官形態(tài)、角果形態(tài)等）、細(xì)胞形態(tài)法（包括氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目、花粉粒大小和形態(tài)等）和染色體計數(shù)法（包括根尖染色體、體細(xì)胞染色體和花粉母細(xì)胞染色體）（張振超 等，2014）。隨著科技快速發(fā)展和分子標(biāo)記技術(shù)的日趨成熟，流式細(xì)胞術(shù)鑒定法、分子標(biāo)記鑒定法、同工酶鑒定法和生理生化指標(biāo)鑒定法也成為判斷植株倍性水平的方法和重要輔助手段（陸曉媚等，2022）。

再生植株的精準(zhǔn)倍性鑒定常通過染色體計數(shù)法和流式細(xì)胞儀來確定（Maluszynska，2003；Ochatt.，2008）。染色體計數(shù)法是一種最直接且準(zhǔn)確的鑒定方法，但操作過程繁瑣、耗時長，鑒定效率低，不適宜大規(guī)模篩選倍性材料。利用流式細(xì)胞儀鑒定植株倍性，具有樣品制備方便、分析快速、準(zhǔn)確性高、所需樣品量少及可測樣品數(shù)量多等優(yōu)點，已成為越來越受歡迎的倍性檢測方法，唯一缺點是檢測成本高。流式細(xì)胞儀鑒定植株倍性在十字花科蔬菜作物中已得到廣泛應(yīng)用（王春麗 等，2010；賈凱 等，2018；Gao et al.，2020；龐強強 等，2021）。而植株形態(tài)法、分子標(biāo)記鑒定法、同工酶鑒定法和生理生化指標(biāo)鑒定法只可作為初步判斷植株倍性的一種輔助技術(shù)手段，由于準(zhǔn)確度不高，根據(jù)試驗?zāi)康倪€需對篩選出來的單倍體或多倍體植株采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行更精準(zhǔn)的倍性水平鑒定。

由于染色體計數(shù)法具有不能大規(guī)模鑒定植株倍性水平的局限性和流式細(xì)胞儀檢測費用高的缺點，在實際試驗過程中大多會在植株生長早期階段應(yīng)用植株形態(tài)法來初步判斷植株倍性，減少冗余工作量，提高倍性鑒定效率。還有學(xué)者以流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果為依據(jù)對再生植株葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目和大小進(jìn)行研究，得出氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目是判斷小孢子再生植株倍性的簡易有效手段，如甘藍(lán)、蕪菁（祁魏崢 等，2015；賈凱 等，2018）。

4.2 自然加倍

通過小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株會發(fā)生不同程度的自然加倍現(xiàn)象。有研究表明，小孢子胚自然加倍與胚胎發(fā)生初期的核內(nèi)有絲分裂有關(guān)，推測在胚誘導(dǎo)初期就已經(jīng)完成自然加倍（Keller &Armstrong，1981；李菲，2006）。除受基因型影響外，培養(yǎng)條件和處理方法都會影響小孢子自然加倍頻率（Zhao et al.，1996）。不同蕓薹屬蔬菜作物的自然加倍頻率差異明顯。大白菜的小孢子再生植株自然加倍率超過70%（Zhang &Takahata，2001）；通過小孢子培養(yǎng)的銀玉白蘿卜再生植株自然加倍率高達(dá)82.21%，其中雙單倍體率為44.17%（張麗等，2016）；在菜薹（菜心）小孢子培養(yǎng)再生植株中，3 個基因型材料經(jīng)自然加倍的二倍體植株率在62.22%～71.11%之間（龐強強 等，2021）；經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的蕪菁甘藍(lán)再生植株自然加倍率較低，為21.70%（趙艷艷 等，2021）；芥菜小孢子培養(yǎng)再生植株自然加倍率更低，僅為4%～6%（Prem et al.，2008）。此外，皮明雪等（2020）通過改變光照條件和低溫處理來提高甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)再生植株的自然加倍率，獲得了1 個胚產(chǎn)量（119.87胚·蕾-1）和自然加倍率（79.87%）均很高的DH系；并證實了光照對一次成苗率和再生植株加倍率并無影響，但基因型對其影響較大，不同基因型材料間自然加倍率可相差2～3 倍。

4.3 人工誘導(dǎo)加倍

部分十字花科蔬菜通過小孢子培養(yǎng)獲得高頻率的單倍體再生植株，無法直接應(yīng)用到基礎(chǔ)育種工作中。因此，對于自然加倍率低的小孢子再生植株，進(jìn)行人工誘導(dǎo)染色體加倍是必要的環(huán)節(jié)。體細(xì)胞染色體加倍可發(fā)生在分生組織細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、幼胚或合子中，分生組織細(xì)胞和薄壁細(xì)胞加倍易導(dǎo)致產(chǎn)生嵌合體，幼胚或合子加倍則容易產(chǎn)生多倍體孢子體（張振超，2012）。

目前報道最多、應(yīng)用效果較好的誘導(dǎo)劑是秋水仙素，誘導(dǎo)發(fā)生加倍的主要作用機制是在細(xì)胞分裂時抑制紡錘絲的形成，染色單體分裂但細(xì)胞質(zhì)不發(fā)生分離，最終導(dǎo)致染色體數(shù)目加倍（周廣芳，1991）。通過化學(xué)藥劑處理小孢子細(xì)胞和再生植株幼苗均能加倍成功。萬麗麗等（2020）對3 個油菜F1的小孢子細(xì)胞采用85 mg·L-1秋水仙堿處理后得到的DH 系植株最多。甘藍(lán)型油菜小孢子再生植株轉(zhuǎn)至含有80 mg·L-1秋水仙堿的MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最高加倍率為43.47%，且成苗率可達(dá)到76.67%（譚少敏 等，2015）。為了提高再生植株的加倍成功率，還有學(xué)者在小孢子培養(yǎng)過程中先將小孢子細(xì)胞用秋水仙堿處理1 次，使一部分小孢子加倍，待再生植株移栽至大田后，在現(xiàn)蕾抽薹期對具有明顯單倍體特征的植株用0.2%秋水仙素 +0.1%二甲基亞砜混合溶液注射至植株下部的分枝腋芽中，加倍率由之前的35.8%～66.4%提高到了61.3%～80.4%（李書宇 等，2018）。

5 應(yīng)用研究

5.1 在抗病抗逆方面

培育抗病、抗逆性強且優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種是十字花科蔬菜的主要育種目標(biāo)。常見的病害對十字花科蔬菜的品質(zhì)、產(chǎn)量和種植面積均有重大影響，有些土傳病害如根腫病、枯萎病等通過傳統(tǒng)的化學(xué)方法和農(nóng)藝措施已很難控制，應(yīng)用抗病、抗逆品種是克服病害最直接有效的途徑（Farnham et al.，2001）。吳安平（2008）應(yīng)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)從構(gòu)建的DH 系群體中經(jīng)抗寒性鑒定篩選出28 份抗寒性極強的DH系種質(zhì)資源。Lv 等（2014）采用高抗枯萎?。?6-100）和易感枯萎?。?1-20）的兩個結(jié)球甘藍(lán)自交系進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，從獲得的196 個DH 群體中通過農(nóng)藝性狀鑒定和分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)篩選出3個優(yōu)異DH 系材料，并與已有的優(yōu)良自交系雜交，對其抗病性和農(nóng)藝性狀評估后得到3 個高抗枯萎病的優(yōu)良組合。Li 等（2020）利用同樣的方法從230份結(jié)球甘藍(lán)DH 群體中篩選出4 個優(yōu)異DH 系與甘藍(lán)自交系雜交，從逾60 份雜交種中篩選出5 份高抗裂球和枯萎病的材料，且在大田種植中表現(xiàn)出良好的農(nóng)藝性狀。Liu 等（2019）以甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)獲得的抗病DH 系材料D134 為抗性供體親本，結(jié)合背景篩選通過回交方式將枯萎病抗性基因成功轉(zhuǎn)育到骨干親本中，獲得1 份高抗枯萎病的親本材料，已成功應(yīng)用到培育抗病品種的研究中。陳麗瀟等（2019）采用10 個抗根腫病大白菜品種進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，從獲得的40 株DH 植株中利用根腫病抗性基因CRa的特異性分子標(biāo)記篩選出27 株攜帶抗性基因的DH 植株。小孢子培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代分子標(biāo)記輔助選擇方法的結(jié)合應(yīng)用大大縮短了獲得具有抗病性優(yōu)異雜交種材料的時間，將直接提高十字花科蕓薹屬蔬菜作物新品種培育的工作效率。

目前為止，雖未見利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成蘿卜新品種的相關(guān)報道，但張麗等（2020）應(yīng)用此技術(shù)有效解決了心里美蘿卜（血紅肉）在常規(guī)自交中出現(xiàn)的淺綠肉變異株問題，這為蘿卜基礎(chǔ)應(yīng)用育種工作提供了參考。

5.2 在基因定位方面

小孢子培養(yǎng)獲得的DH 系群體是識別分子標(biāo)記和構(gòu)建遺傳基因圖譜的理想材料（Kitashiba et al.，2016；Liu et al.，2017；Valdés et al.，2018）。Kitashiba 等（2016）在蕪菁小孢子培養(yǎng)過程中通過偏分離分析確定了3 個與胚產(chǎn)量相關(guān)的基因位點，并證實了它們對胚產(chǎn)量的遺傳影響。Lv 等（2014）利用DH 群體和F2分離群體，將甘藍(lán)枯萎病抗性基因FOC1精細(xì)定位于C06 染色體84 kb 區(qū)間內(nèi)。Su 等（2015）利用甘藍(lán)DH 群體構(gòu)建了基于SSR和InDels 標(biāo)記的高密度遺傳連鎖圖譜，并對耐裂球性狀進(jìn)行QTL 定位。王會等（2014）基于甘藍(lán)型油菜DH 群體對抗裂角性的遺傳研究表明，抗裂角性主要受3 對主基因+多基因控制，且主基因遺傳率大于85.00%，其他微效基因和環(huán)境因子的影響較小。Song 等（2021）對生長在3 種不同環(huán)境條件下甘藍(lán)型油菜DH 群體的開花時間進(jìn)行QTL 定位，發(fā)現(xiàn)了2 個主效QTLs，在半冬性油菜生長區(qū)檢測到1 個主效QTL 位于A03 染色體上，在3 種不同生長環(huán)境下的甘藍(lán)型油菜中均檢測到C08 染色體上的1 個主效QTL，并對QTL 內(nèi)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，獲得4 個與開花時間相關(guān)的候選基因。安談洲（2021）對甘藍(lán)型油菜分枝數(shù)和腋芽數(shù)有差異的兩個育種親本構(gòu)建的DH 群體進(jìn)行QTL掃描，發(fā)現(xiàn)一次分枝數(shù)的QTL 有5 個，腋芽數(shù)的QTL 有6 個。

5.3 在突變體篩選方面

創(chuàng)制豐富的突變體材料是試驗研究和品種改良的重要途徑之一。Huang 等（2016）利用0.12%EMS（V/V）溶液處理大白菜小孢子10 min 后轉(zhuǎn)移至NLN-13 液體培養(yǎng)基中，最終從1 304 份再生植株中獲得6 株具有穩(wěn)定遺傳性狀的突變體植株，為克隆有利突變基因、植物育種和功能基因組學(xué)研究提供了材料基礎(chǔ)。使用雄性不育系獲得雜交種是利用雜種優(yōu)勢的一種重要途徑。譚翀（2018）應(yīng)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)和60Co γ-射線誘變結(jié)合的方法從大白菜FT DH 系中創(chuàng)制出1 份穩(wěn)定遺傳的雄性不育突變體，命名為ftms。此后，Huang 等（2020）采用同樣的方法也獲得了1 份雄性不育突變體（msm）材料，除雄蕊發(fā)育情況不同外，大白菜FT 和msm的遺傳背景高度一致，成功創(chuàng)制出的突變體是研究大白菜雄蕊發(fā)育分子機制的理想材料。

5.4 在新品種培育方面

傳統(tǒng)育種方法是通過多年系統(tǒng)選育獲得穩(wěn)定的胞質(zhì)雄性不育系、自交系及自交不親和系作為親本，培育出多種類型的十字花科蔬菜新品種，但親本純化時間長、育種成本高、受環(huán)境因素影響也較大。隨著十字花科蔬菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系的不斷改進(jìn)和成熟，近年來多家研究院所利用此技術(shù)獲得了大量優(yōu)異純合的DH 系新種質(zhì)，通過田間株系間雜交、回交和自交等常規(guī)育種技術(shù)及分子標(biāo)記輔助選育手段相結(jié)合的方法，創(chuàng)制出一批聚合多個優(yōu)良性狀的育種材料，培育出多個滿足生產(chǎn)和市場需求的不同成熟期、不同產(chǎn)品類型且抗病抗逆性強的新品種。

我國最早利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)成功培育出十字花科蔬菜新品種的育種單位是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院葉類蔬菜生物育種創(chuàng)新團隊，率先建立了一套完善的大白菜游離小孢子培養(yǎng)體系（栗根義 等，1993），在育成第1 個大白菜品種豫白菜7 號（豫園1 號）（栗根義 等，1998）后，又培育出豫園、豫新系列大白菜新品種（栗根義 等，1999；耿建峰 等，2002，2003；張曉偉 等，2002a，2002b，2004；原玉香 等，2004；蔣武生 等，2005；姚秋菊 等，2008a，2008b）；此后，又將該技術(shù)應(yīng)用于甘藍(lán)育種，快速培育出國內(nèi)第1 個利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育的甘藍(lán)新品種—豫生1 號（張曉偉等，2001），之后又育成豫生和豫甘系列甘藍(lán)新品種（張曉偉 等，2008a，2008b；姚秋菊 等，2015；張曉偉和姚秋菊，2016），已規(guī)?；瘧?yīng)用到生產(chǎn)實踐中，推廣種植面積大，市場經(jīng)濟效益顯著增加。

隨后，國內(nèi)其他科研院所及學(xué)校利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)也相繼培育出大白菜、甘藍(lán)、青花菜和花椰菜等十字花科蔬菜新品種，例如苗球兼用型的早熟8 號（胡齊贊 等，2008），耐貯運、高抗根腫病的CCR11242（徐學(xué)忠 等，2015），早熟、耐抽薹性強的秦春3 號（趙利民 等，2019）及長筒青麻葉類型的珍綠60（聞鳳英 等，2017）等大白菜新品種；早熟，耐抽薹、耐裂球性強，高抗病毒病、霜霉病、黑腐病和干燒心的秦甘58（張恩慧，科技成果），耐先期抽薹、高抗枯萎病的YR 中甘21（呂紅豪 等，2021）和適宜密植的張甘60（申領(lǐng)艷 等，2021）等甘藍(lán)新品種；春秋兼用型、抗黑腐病和霜霉病的領(lǐng)秀2 號（劉莉莉 等，2018），晚熟、適宜密植、綜合抗性良好的浙青95（王建升等，2018）和早熟性突出的浙青60（王建升 等，2020）等青花菜新品種；耐熱，高抗軟腐病、黑腐病和菌核病的松花55 天（陳文輝 等，2011），中熟、適用于脫水加工的浙801 和浙017（顧宏輝 等，2011，2012），耐熱、耐濕的優(yōu)松68（單曉政 等，2021）等花椰菜新品種。這些具有綜合優(yōu)良性狀的抗病抗逆新品種有效降低了生產(chǎn)過程中病害的發(fā)生情況，生產(chǎn)成本降低，經(jīng)濟效益明顯提高。此外，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所在芥藍(lán)新品種培育中，利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)快速純化親本，采用雄性不育系或自交不親和系選育出了抗逆性強、豐產(chǎn)性好、品質(zhì)優(yōu)良的芥藍(lán)一代雜種（陳漢才 等，科技成果）。

6 展望

近年來，通過對小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系的不斷優(yōu)化，此技術(shù)在十字花科蔬菜基礎(chǔ)研究和育種應(yīng)用中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。多種十字花科蔬菜都獲得了一定數(shù)量的優(yōu)良純系種質(zhì)資源，并成功應(yīng)用于育種實踐中，但蘿卜、菜薹（菜心）的小孢子誘導(dǎo)成功率仍然較低，主要受基因型制約。有報道稱，熱激處理導(dǎo)致生長素以極性方式存在于小孢子中，從而促使了小孢子胚胎發(fā)生的啟動，誘導(dǎo)小孢子從配子體轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育過程，但并非所有的基因型都能誘導(dǎo)成功（Dubas et al.，2014；Zhang et al.，2020）。對此，還需進(jìn)一步研究探索出新方法來克服，提高優(yōu)異育種材料的出胚率和雙單倍體植株成苗數(shù)量，提高小孢子培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢利用率。研究小孢子胚胎發(fā)生過程可以更好地了解合子胚發(fā)生過程，但迄今為止對于小孢子胚胎發(fā)生的分子機理研究仍不透徹。

多數(shù)學(xué)者利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)建了十字花科不同蔬菜種類的DH 群體，從中篩選出抗病抗逆性強、可供育種研究利用的雄性不育系突變體材料，同時通過基因定位挖掘出一些在小孢子胚胎發(fā)生過程中的相關(guān)基因及遺傳育種中重要性狀的分子標(biāo)記，可以加快十字花科蔬菜作物重要農(nóng)藝性狀關(guān)鍵基因的克隆。小孢子培養(yǎng)技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇方法相輔相成來開展十字花科蔬菜基礎(chǔ)應(yīng)用研究和深入的遺傳學(xué)育種研究，可以使小孢子胚胎發(fā)生、誘導(dǎo)胚狀體直接成苗及再生植株自然加倍等3 個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行改良的同時，快速獲得更多優(yōu)異的種質(zhì)資源。