異常威克漢姆酵母在白酒釀造中的應(yīng)用研究

謝再斌，王太玉，王 茜，覃先武，，李武陽，常 煦，陳 暉，許引虎，*

（1.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003；2.湖北屈姑國際農(nóng)業(yè)集團(tuán)索萊斯酒業(yè)有限公司，湖北秭歸 443600；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）是子囊菌屬的一種，細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，能夠通過出芽方式進(jìn)行無性繁殖以及形成帽狀或球形子囊孢子進(jìn)行有性繁殖，其廣泛存在于葡萄、桑葚、柑橘等水果表面，同時也可從谷物、玉米等青貯飼料、高糖食品、傳統(tǒng)酒曲中分離得到[1-2]。由于其具有耐酸性、低水分活性、高滲壓和厭氧等極端環(huán)境條件，以及對曲霉、青霉、鐮孢霉等真菌和歐文氏菌、腸桿菌、鏈球菌等細(xì)菌的多種物種具有抗菌活性的特點，因此異常威克漢姆酵母可廣泛應(yīng)用于食品保鮮、飼料加工、乳制品發(fā)酵、廢水處理、釀酒生產(chǎn)等領(lǐng)域[3-5]。在釀酒生產(chǎn)方面，異常威克漢姆酵母能夠分泌β-D-葡萄糖苷酶、β-D-木糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶等多種糖苷酶，從而能夠促進(jìn)香氣風(fēng)味物質(zhì)的形成，并且其具有高產(chǎn)乙酸乙酯、2-苯乙醇的能力，因此能夠用于提升酒質(zhì)感官質(zhì)量[6-8]。異常威克漢姆酵母已被逐步應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)中，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ墓I(yè)微生物菌種。本文對異常威克漢姆酵母的來源、對酒類風(fēng)味的影響及其在酒類釀造中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對異常威克漢姆酵母在釀酒中的應(yīng)用前景提出展望，為篩選優(yōu)良酵母菌株，優(yōu)化酒類發(fā)酵條件，提高酒體品質(zhì)提供理論參考，對促進(jìn)釀酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有一定意義。

1 異常威克漢姆酵母的來源

1.1 水果中的異常威克漢姆酵母

果酒通常是以葡萄、柑橘、蘋果等水果為原料，破碎壓榨后經(jīng)發(fā)酵或浸泡等工藝，釀制調(diào)配而成的飲料酒，因其具有酒精度低、香氣濃郁、營養(yǎng)豐富等特點而深受消費(fèi)者的喜愛[9-10]。在果酒發(fā)酵過程中，非釀酒酵母可以產(chǎn)生果膠酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等胞外酶系，這些酶類可作用于果汁中葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白質(zhì)、果膠等相關(guān)底物，進(jìn)而影響果酒的成分組成及風(fēng)味物質(zhì)[11]。此外，一些非釀酒酵母還可產(chǎn)生較高濃度的甘油，能夠增加果酒的醇厚感與復(fù)雜度[12]。

異常威克漢姆酵母是一種非釀酒酵母，常存在于葡萄、桑葚、柑橘等多種水果表面。蔣麗等[13]從川藏高原地區(qū)采摘的冰葡萄果實中分離純化出異常威克漢姆酵母，并對其耐受性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母在8 ℃低溫以及質(zhì)量濃度為700 mg/L的高二氧化硫的環(huán)境中均能表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。劉陽等[14]從柑橘果皮中篩選鑒定出一株產(chǎn)生濃郁香味的異常威克漢姆酵母Y13，并對其發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株Y13最主要的香氣成分為苯乙醇，且相對含量在30%以上。馮濤等[15]對異常威克漢姆酵母的產(chǎn)香能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與商業(yè)酵母發(fā)酵酒相比，異常威克漢姆酵母發(fā)酵酒中的苯乙醇和乙酸含量明顯高于商業(yè)酵母，由此也證實了異常威克漢姆酵母最主要的香氣成分為苯乙醇，其具有發(fā)酵增香的功能。

1.2 傳統(tǒng)酒曲中的異常威克漢姆酵母

作為歷史悠久，工藝獨特的中國白酒，是與白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒、金酒并稱的“世界六大蒸餾酒”。利用酒曲進(jìn)行釀酒是中國白酒的特色[16]。中國及東南亞地區(qū)的酒曲是一種具有糖化、發(fā)酵、生香等多功能的富含微生物菌系、酶系和曲香物質(zhì)的微生態(tài)制劑，其通常是在人為控制的一定溫度、濕度條件下，經(jīng)過粉碎、加壓等步驟而得到的磚塊狀曲坯[17]。異常威克漢姆酵母主要存在于清香型酒曲中，另外從醬香型、濃香型、陶香型等酒曲中也能分離獲得[18-22]。

清香型白酒作為中國白酒中三大基本香型之一，具有清爽、純凈、自然、舒適的酒體風(fēng)格[23]。杜艾明等[19]從黃鶴樓清香型大曲中共分離得到釀酒酵母、東方伊薩酵母、異常威克漢姆酵母、扣囊復(fù)膜酵母和扁平云假絲酵母5大類型酵母，并發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和異常威克漢姆酵母在數(shù)量上占優(yōu)勢，其中異常威克漢姆酵母酯化酶活力最高，達(dá)到10.42 U/mL。王鵬昊等[20]從清香小曲中分離獲得一株異常威克漢姆酵母Y5，并對其產(chǎn)酯條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度30 ℃、pH 4.0、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.0%、發(fā)酵時間3 d。在此優(yōu)化條件下，菌株的產(chǎn)酯量達(dá)到最高峰，其總酯及乙酸乙酯含量與優(yōu)化之前相比，分別提高了51.5%、48.2%。

醬香型白酒是中國特有的蒸餾酒，其生產(chǎn)工藝獨特，酒體風(fēng)味獨到，其中，貴州茅臺酒是醬香型白酒的典型代表，是與蘇格蘭威士忌、法國柯涅克白蘭地齊名的世界三大蒸餾名酒[24]。盧延想等[25]從醬香大曲中分離得到產(chǎn)β-苯乙醇、異戊醇、異戊酸等43風(fēng)味物質(zhì)的扣囊復(fù)膜酵母Y3以及產(chǎn)β-苯乙醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、異戊酸等37風(fēng)味物質(zhì)的異常威克漢姆酵母Y5，并將菌株Y3、Y5等比例混合添加至醬香型白酒發(fā)酵的酒醅中，發(fā)現(xiàn)菌株Y3和Y5能夠顯著提升醬香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇含量。

濃香型白酒因起源于四川瀘州，又被稱為瀘型酒，是中國傳統(tǒng)白酒中產(chǎn)量最大、市場占有率最高的白酒香型，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[26]。明紅梅等[21]采用傳統(tǒng)微生物分離法從濃香型大曲中分離純化獲得地衣芽孢桿菌X19與異常威克漢姆酵母J3，并對其發(fā)酵產(chǎn)物的香味成分進(jìn)行了測定分析，發(fā)現(xiàn)兩株菌的發(fā)酵產(chǎn)物中包含了吡嗪類、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚等香味物質(zhì)，種類豐富。范光森等[27]從古井貢酒曲中分離鑒定得到具有較好NaCl耐受性的異常威克漢姆酵母Y1401以及具有耐受酒精度14.0%vol的菌株Y1507，之后通過測定兩株菌的發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味，發(fā)現(xiàn)兩株酵母均能產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，并以酯類物質(zhì)居多。

作為新型白酒的陶香型酒種，其融合了濃香、清香、醬香、芝麻香4種典型酒體風(fēng)格[28]。侯建光等[22]從仰韶陶香型窖池糟醅中篩選出一株能夠產(chǎn)生濃郁的酒香味和水果香味的酵母YS/Y/22，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定為異常威克漢姆酵母，之后以豆芽汁培養(yǎng)基為底物，對該菌進(jìn)行了單菌產(chǎn)香實驗，發(fā)現(xiàn)該菌株的主要香味成分為乙酸乙酯。陳蒙恩等[29]從不同發(fā)酵階段的陶香型大曲中分離純化獲得一株異常威克漢姆酵母YSY04，該菌株能產(chǎn)生濃郁的香味，隨后對其揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中含有陶香型大曲重要香味成分，包括吡嗪類、萜烯類、苯乙醇和2,3-丁二醇等物質(zhì)，種類豐富。

米酒又稱甜酒，一般以優(yōu)質(zhì)米為主要原料，經(jīng)過微生物的酸化、糖化、酒化和酯化等一系列生化過程及其代謝的協(xié)調(diào)作用釀制而成，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特、甘飴可口[30]。TIAN S F等[31]從米酒發(fā)酵醪液中分離得到一株野生型異常威克漢姆酵母，通過優(yōu)化初始葡萄糖和L-苯丙氨酸濃度，在搖床中獲得2 630.7 mg/L 2-苯乙醇。之后，優(yōu)化了初始葡萄糖濃度、L-苯丙氨酸濃度、pH值和接種量等條件，并在5 L生物反應(yīng)器中采用分批補(bǔ)料方式進(jìn)行2-苯乙醇的生產(chǎn)。結(jié)果表明在最優(yōu)條件下，2-苯乙醇效價為4 727.3 mg/L。

2 異常威克漢姆酵母對酒類風(fēng)味的影響

酯類物質(zhì)是白酒發(fā)酵過程中及后期陳釀階段，酒體里的有機(jī)酸和醇類物質(zhì)在釀酒微生物或酶的作用下反應(yīng)得到一類具有芳香性氣味的化合物，多呈現(xiàn)果香、花香，酯類在白酒中的呈香作用可在不同程度上增加酒體香氣的愉悅感，是形成酒體香氣濃郁的主要因素。在白酒中，起主要呈香作用的酯類有己酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯，三者之和占總酯含量的85%以上，因此被稱作白酒中的三大酯[32]。酯類化合物的含量高低及穩(wěn)定性，可直接影響白酒的風(fēng)味感官質(zhì)量[33]。

產(chǎn)香酵母又名產(chǎn)酯酵母，能合成具有芳香氣味的酯類物質(zhì)，如今產(chǎn)香酵母泛指在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生香氣成分的各種酵母的總稱，香氣多為醇類、酯類、酚類、酮類、芳香類等具有揮發(fā)性風(fēng)味的物質(zhì)，主要的香氣類型有：花香型、清香型、果香型等，常被廣泛應(yīng)用于釀造、調(diào)味品、功能性飲料等領(lǐng)域的增香增味[34]。產(chǎn)香酵母歸屬于生膜酵母和假絲酵母，大多數(shù)為異型漢遜酵母及少數(shù)小圓型酵母屬，是一類能夠生成香味成分的酵母菌[35]。異常威克漢姆酵母是一種產(chǎn)香酵母，具有一定的產(chǎn)香產(chǎn)酯能力。

在果酒中，葉萌祺等[36]將異常威克漢姆酵母YN6與釀酒酵母WLS21進(jìn)行混合發(fā)酵，結(jié)果表明，與釀酒酵母WLS21單獨發(fā)酵相比，混合發(fā)酵能夠增加酒體中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類及含量。劉叢竹等[37]以菠蘿、火龍果、葡萄制成的復(fù)合果汁，利用果酒酵母和異常維克漢姆酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵比果酒酵母單菌發(fā)酵更快，并且酒中乙酸乙酯含量提高了32.10%，達(dá)到了50.55 mg/L，高級醇含量也提高到251.09 mg/L，同時總有機(jī)酸降低到4.94 g/L。由此表明，異常威克漢姆酵母產(chǎn)香能力較強(qiáng)，且能夠顯著提高果酒的感官質(zhì)量。

在白酒中，明紅梅等[38]采用響應(yīng)面法對異常威克漢姆酵母J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇條件進(jìn)行優(yōu)化研究，結(jié)果表明最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度35 ℃，初始水分含量43%，裝料量70 g/250 mL，發(fā)酵時間9 d，在該條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中的苯乙醇含量為6.350 mg/100 g，與優(yōu)質(zhì)濃香型大曲相比，其含量增長了5倍多。陳玉香等[39]以福建紅曲中分離得到的異常維克漢姆酵母為對象，研究發(fā)酵溫度對異常維克漢姆酵母產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)在不同溫度條件下，大部分醇類物質(zhì)均呈緩慢上升的趨勢，發(fā)酵終點含量接近；酯類物質(zhì)可達(dá)到的峰值接近。高溫發(fā)酵時，酯類風(fēng)味物質(zhì)含量峰值高于低溫發(fā)酵的同期水平，而后含量顯著下降；其發(fā)酵終點酯類物質(zhì)含量明顯低于低溫發(fā)酵。由此表明，前期高溫發(fā)酵、后期低溫發(fā)酵的控溫模式有利于風(fēng)味物質(zhì)的合成與積累。

3 異常威克漢姆酵母在酒類釀造中的應(yīng)用

目前，由于異常威克漢姆酵母具有高產(chǎn)乙酸乙酯、2-苯乙醇的能力，因此已被廣泛應(yīng)用于果酒、米酒、濃香型白酒、清香型白酒、米香型白酒等酒類釀造中。在果酒釀造中，申光輝等[40]從白酒酒曲中分離篩選獲得1株產(chǎn)濃郁果香氣味，且對糖、SO2及乙醇均有良好耐受性的異常威克漢姆酵母Z133，并用其進(jìn)行發(fā)酵得到了低醇西瓜果酒。之后對酒體的香氣成分進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)酵西瓜汁相比，酒體中醇類和酯類香氣成分種類和相對含量都有所增加，其中包括苯乙醇、乙酸香葉酯和乙酸異戊酯等重要香氣成分。由此表明，從酒曲中獲得的異常威克漢姆酵母Z133在低醇西瓜果酒發(fā)酵中具有一定的應(yīng)用價值。劉曉柱等[41]將異常威克漢姆酵母單獨接種和異常威克漢姆酵母與釀酒酵母混合接種方式發(fā)酵空心李果酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨接種組相比，兩種接種方式均可降低空心李果酒酸類物質(zhì)含量；而單獨接種組發(fā)酵空心李果酒中醇類和其他類化合物種類增多，酯類、醇類和醛酮類化合物含量增加。因此，單獨接種異常威克漢姆酵母對空心李果酒有降酸作用，同時可改善其香氣組分的種類和含量。

在米酒釀造中，陳麗花等[42]從甜酒曲中分離得到CMY002和NBY002兩株異常威克漢姆酵母，后對其耐受性及發(fā)酵力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株CMY002對體積分?jǐn)?shù)＞10%的乙醇耐受性較好，菌株NBY002對溫度耐受性良好；兩株菌在pH 3.0～11.0的條件下均能生長；菌株NBY002的產(chǎn)酯量高，為5.125 g/L；在米曲汁培養(yǎng)基中，菌株CMY002的發(fā)酵產(chǎn)香更加濃郁，菌株NBY002的發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)較強(qiáng)的花香味；菌株NBY002具有較強(qiáng)產(chǎn)2-苯乙醇的能力。由此表明，異常威克漢姆酵母具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯產(chǎn)香能力。

在濃香型白酒釀造中，趙志軍等[43]從糟醅中分離篩選得到1株高產(chǎn)酯的異常威克漢姆酵母S5，并對該菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)條件為初始pH 4.95，發(fā)酵時間3 d，初始糖（葡萄糖）質(zhì)量濃度60 g/L。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中總酯含量為7.67 g/L，比優(yōu)化前提高了64.2%。由此可見，異常威克漢姆酵母S5對濃香型白酒品質(zhì)的提高具有潛在的應(yīng)用價值。

在清香型白酒釀造中，許銀等[44]從濃香型大曲中分離得到異常威克漢姆酵母Y87與釀酒酵母Y88，并將其應(yīng)用于清香型小曲白酒工業(yè)生產(chǎn)。結(jié)果表明，異常威克漢姆酵母Y87能夠提高乙酸乙酯的產(chǎn)量，并且其強(qiáng)化曲釀造的白酒中乙酸乙酯含量提高36.6%，雜醇含量降低7.1%，正丙醇含量降低16.1%，感官評分為90.7分，該白酒具有清香型小曲白酒入口醇甜、清香純正的典型特征，由此也表明異常威克漢姆酵母Y87可顯著提高小曲白酒的品質(zhì)。為了穩(wěn)定異常威克漢姆酵母的活性，增加基酒的總酯含量，史雁飛等[45]對異常威克漢姆酵母Y5-5進(jìn)行了固定化條件優(yōu)化，并分析固定化異常威克漢姆酵母對釀酒過程的影響，發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母Y5-5 的最佳固定化條件為：海藻酸鈉添加量3%，氯化鈣濃度2.0 mol/L，固定化溫度25 ℃，包埋菌液異常威克漢姆酵母Y5-5的濃度為109個/mL。在此條件下，發(fā)酵液殘?zhí)橇拷抵磷畹?，固定化效果最好。后對固定化酵母?yīng)用于釀酒試驗，發(fā)現(xiàn)固定化酵母發(fā)酵的酒體中的總酸、酒精度和pH等方面和與對照組接近，而總酯含量高達(dá)3.4 g/L，比原來提高了1倍左右，說明海藻酸鈉與氯化鈣溶液鈣化后形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可有效保護(hù)異常威克漢姆酵母，從而提高酒體中的酯產(chǎn)量，對清香白酒口味的提高有重大意義。

在米香型白酒釀造中，吳健等[46]將異常威克漢姆酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母、釀酒酵母、米根霉制備成風(fēng)味酒曲，并對制曲工藝進(jìn)行了優(yōu)化，后以市售小曲為對照，對風(fēng)味酒曲中的指標(biāo)進(jìn)行了檢測，同時采用半固態(tài)發(fā)酵方式制備米香型白酒進(jìn)行驗證。結(jié)果表明，最優(yōu)制備工藝為酵母接種量1.0%，培養(yǎng)時間73 h，培養(yǎng)溫度30 ℃。在此優(yōu)化條件下，風(fēng)味酒曲水分含量為10.58%，糖化力為423.77 U/g，發(fā)酵力為2.24 g/（g·72 h），經(jīng)半固態(tài)法實際釀酒后，酒體總酯及總酸含量分別為6.87 g/L、1.63 g/L，感官評分為92分，具備米香型白酒的典型風(fēng)格，且風(fēng)味明顯提升。

4 展望

異常威克漢姆酵母因具有較強(qiáng)的產(chǎn)香產(chǎn)酯能力，因此在酒類釀造中具有較強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿Αｈb于異常威克漢姆酵母的功能特性，可對其應(yīng)用前景進(jìn)行如下展望：

①目前，在四川、貴州、云南等地區(qū)，由于川法小曲酒清香純正、糟香宜人、醇和爽口、出酒率高、價格低廉，受到人們的普遍喜愛。但是小曲酒中的風(fēng)味物質(zhì)較低，口味淡薄，因此經(jīng)常用作濃香型白酒的基酒。異常威克漢姆酵母由于具有一定的產(chǎn)香產(chǎn)酯能力，可以考慮將其運(yùn)用于川法小曲酒中，讓川法小曲酒的酒質(zhì)得以提升。

②充分了解異常威克漢姆酵母與其他菌種之間的關(guān)系，利用之間的拮抗、互利共生等關(guān)系，來抑制某些病原微生物的生長，用于發(fā)明新型無污染的殺菌劑。同時，可發(fā)揮異常威克漢姆酵母與其他菌種各自的優(yōu)點、取長補(bǔ)短，進(jìn)行混合發(fā)酵，生產(chǎn)出成本更低、質(zhì)量更高的產(chǎn)品。

③異常威克漢姆酵母能夠分泌β-D-葡萄糖苷酶、β-D-木糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶，并具有高產(chǎn)乙酸乙酯、2-苯乙醇的能力，由此可以考慮運(yùn)用基因工程育種技術(shù)將目標(biāo)基因引入到其他優(yōu)良菌株載體中，構(gòu)建新型菌株，使其能夠產(chǎn)生多種優(yōu)良性狀，從而使工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量得以提高。

④低溫發(fā)酵可以提高酒類揮發(fā)性物質(zhì)的穩(wěn)定性，減少蒸發(fā)損失。有研究表明，非釀酒酵母往往比釀酒酵母更耐受低溫脅迫，異常威克漢姆酵母具有一定的抗凍能力，同時在利用異常威克漢姆酵母進(jìn)行發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)前期高溫發(fā)酵、后期低溫發(fā)酵的控溫模式更有利于風(fēng)味物質(zhì)的合成與積累。因此可進(jìn)行其在低溫脅迫下的代謝組學(xué)及蛋白組學(xué)分析，以促進(jìn)其在酒類釀造中的應(yīng)用。