基于QuEChERS-GC-MS/MS法同時測定獼猴桃中15種有機磷農(nóng)藥殘留

韓世明，李 志，2 *，王月霞，方玉梅

（1.六盤水市師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水 553004；2.貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心果蔬實驗室，貴州 六盤水 553000）

獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch）又名藤梨、羊桃、木子，為側(cè)膜胎座目，獼猴桃科，獼猴桃屬，獼猴桃種，落葉藤本植物[1-3]，獼猴桃果汁多、風(fēng)味宜人，富含維生素C（vitamin C，VC）、氨基酸、多糖、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[4-5]，具有提升免疫功能、治療肝臟疾病、消化不良、抑制腫瘤等功效，對人體健康具有促進作用[6]，因此深受消費者喜愛。果農(nóng)為提高獼猴桃產(chǎn)量，農(nóng)藥在其生長過程中被廣泛應(yīng)用于病、蟲、草害等防治，因存在農(nóng)藥不合理使用的問題，獼猴桃中存在農(nóng)藥污染風(fēng)險。因此，建立獼猴桃中農(nóng)藥殘留量的快速檢測方法，對于保證獼猴桃的質(zhì)量安全具有重要作用。

有機磷農(nóng)藥是我國目前使用范圍最廣、藥用最大的農(nóng)藥。作為殺蟲劑、除草劑、殺真菌劑[7-8]，有機磷農(nóng)藥具有廣譜、高效、用量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域，但與此同時產(chǎn)生的環(huán)境問題也日益嚴重。目前，有機磷農(nóng)藥的檢測方法主要有拉曼光譜法、免疫分析法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS），其中LC-MS和GC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用最廣[9-10]，其具有分析范圍廣、分離能力強、檢測限低、分析時間快和自動化程度高等優(yōu)點，已成為農(nóng)藥殘留分析的重要方法之一。較傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測方法，QuEchERS（quick，easy，chenp，effective，rugged，safe）前處理方法具有凈化效果好、重復(fù)性強、靈敏度高等優(yōu)勢，能有效消除基質(zhì)干擾，減少假陽性的檢出率，簡化樣品的前處理，降低分析成本。近年來，國內(nèi)外已有關(guān)于QuEChERS方法作為農(nóng)獸藥殘留檢測的前處理方法的文獻報道，蔣曉勤等[11]采用QuEChERS法萃取-氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定果蔬中58種農(nóng)藥殘留；王興寧等[12]采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，UHPLC-Q-Orbi trap HRMS）法快速檢測果蔬中84種除草劑殘留；HAN M等[13]采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中48種農(nóng)藥殘留。

目前，關(guān)于獼猴桃農(nóng)藥殘留檢測報道主要以NY/T761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》的氣相色譜法為主，還鮮見以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析檢測獼猴桃中的農(nóng)藥殘留的文獻報道。因此，本研究通過對獼猴桃樣品中15種有機磷農(nóng)藥的提取、凈化條件進行考察和優(yōu)化以改良QuEchERS前處理法，并結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法，建立了同時快速檢測獼猴桃中15種有機磷農(nóng)藥殘留的方法，并將其應(yīng)用于市售獼猴桃樣品的篩查檢測，為確保獼猴桃質(zhì)量安全提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃（六盤水紅心獼猴桃）（編號為1#～20#）：市售。乙腈、甲苯（均為色譜純）：德國Merck公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）：美國Fisher公司；無水硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）（均為分析純）：日本Shimadzuac公司；環(huán)氧七氯（1 000 μg/mL，1.0 mL）、敵敵畏、對硫磷、喹硫磷、苯硫磷、治螟磷、三唑磷、久效磷、速滅磷、益棉磷、保棉磷、乙拌磷、除線磷、滅線磷、丙溴磷、毒死蜱標準品（均為100 μg/mL，1.2 mL）：北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS/MS-TQ8040三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（配AOC-20i+s自動進樣器）：日本島津公司；Q24RC快速組織低溫破碎勻漿儀：北京昊諾斯科技有限公司；XPR分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；XH-B旋渦混合器：上海鴻志實驗儀器有限公司；MultifugePro高性能通用臺式離心機：賽默飛世爾科技實驗室產(chǎn)品；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：濟南禾普儀器設(shè)備有限公司；WIGGENS氮吹儀：維根技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備及QuEChERS樣品前處理

于20份獼猴桃樣品中隨機選取無腐爛的獼猴桃，用研磨儀粉碎成獼猴桃汁后裝入潔凈的盛樣容器中，放入2～4 ℃環(huán)境中備用。

QuEChERS前處理：稱取10.0 g（精確至0.001 g）獼猴桃汁于50mL離心管中，加入10mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），旋渦振蕩提取10 min，加入氯化鈉10 g，再旋渦振蕩提取5 min，將離心管放入離心機，以6 000 r/min離心8 min，取上清液5 mL，加入稱有最佳配比的PSA、GCB、C18、無水硫酸鎂的離心管中，旋渦振蕩混勻，以8 000 r/min離心10 min。取全部上清液于試管中置于38 ℃氮吹至近干，加入0.1 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的環(huán)氧七氯內(nèi)標溶液，用乙酸乙酯定容至1 mL，過0.22 μm有機相微孔濾膜，供GC-MS/MS分析。

1.3.2 標準溶液的配制

環(huán)氧七氯內(nèi)標溶液的配制：準確量取100 μL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的環(huán)氧七氯儲備液，于2～4 ℃冷藏保存。

15種混合農(nóng)藥標準儲備液的配制：分別隨機選取10種農(nóng)藥，各量取1 mL于10 mL容量瓶中并于38 ℃氮吹至近干后，再量取剩余5種農(nóng)藥各1 mL于容量瓶中，并用正己烷定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合農(nóng)藥標準儲備液，于2～4 ℃冷藏保存。

15種農(nóng)藥基質(zhì)混合標準工作溶液的配制：按照1.3.1方法前處理不含目標農(nóng)藥的“空白”獼猴桃樣品，即得空白基質(zhì)提取液，分別精密移取10 μg/mL混合農(nóng)藥標準儲備液于進樣瓶中，加入環(huán)氧七氯內(nèi)標液，用空白基質(zhì)提取液定容，得到稀釋至質(zhì)量濃度為0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50 μg/mL和1.00 μg/mL的系列混合標準工作溶液，其中分別含內(nèi)標環(huán)氧七氯1 μg/mL。

1.3.3 氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

色譜條件：Rxi-5SilMS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%）；柱溫的升溫程序為初始溫度50 ℃，保留1 min，以25 ℃/min升溫至150 ℃，保留3 min，再以10 ℃/min升溫至300 ℃，保留7 min；載氣控制方式為恒線速度；不分流進樣；進樣口溫度280 ℃；線速度19.45 cm/s；溶劑延遲時間3 min；柱流量1.78 mL/min，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；接口溫度290 ℃；碰撞氣為氬氣（Ar）（純度≥99.999%）；檢測器電壓（相對于調(diào)諧結(jié)果）0.5 kV；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，具體參數(shù)見表1。

表1 環(huán)氧七氯及15種農(nóng)藥組分的CAS號和多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 CAS number and multiple response monitoring parameters of heptachlor epoxy and 15 pesticide components

1.3.4 不同提取溶劑對各組分回收率的影響

農(nóng)藥種類繁多，根據(jù)不同農(nóng)藥的性質(zhì)選擇不同提取溶劑對分析結(jié)果的準確性至關(guān)重要[14-18]。因一些樣品成分復(fù)雜，用單一溶劑提取樣品中農(nóng)藥殘留效果不佳，需要幾種溶劑混合提取才能滿足農(nóng)藥分析。以回收率為考察指標，按照QuEChERS前處理方法對農(nóng)藥常用提取溶劑（二氯甲烷、乙腈、乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V））的提取效果進行考察。

1.3.5 不同凈化方法對各組分回收率的影響

農(nóng)藥殘留檢測中常用到的凈化劑有乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（GCB）、無水MgSO4等[19-21]。由于獼猴桃樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，富含糖類、蛋白質(zhì)、色素等成分，本試驗選取3種組合吸附劑作為獼猴桃樣品提取液凈化劑，分別為25 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB+100 mg無水MgSO4（A組）、50 mg PSA+100 mg C18+20 mg GCB+200 mg無水MgSO4（B組）、100 mg PSA+200 mg C18+40 mg GCB+300 mg無水MgSO4（C組）作對比試驗，考察凈化劑對農(nóng)藥回收率的影響。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

在農(nóng)藥殘留分析中基質(zhì)效應(yīng)普遍存在，會對農(nóng)藥殘留分析方法的準確度、靈敏度、重復(fù)性等產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或增強效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果影響越小，反之亦然。以目標物（農(nóng)藥）的質(zhì)量濃度與內(nèi)標物（環(huán)氧七氯）質(zhì)量濃度的比值和對應(yīng)目標物（農(nóng)藥）峰面積與內(nèi)標物（環(huán)氧七氯）峰面積的比值繪制標準曲線，以峰面積比（y）為縱坐標，以質(zhì)量濃度比（x）為橫坐標，繪制標準曲線，分別得到基質(zhì)匹配校準線性方程和溶劑標準線性方程?；|(zhì)效應(yīng)的計算[22-24]公式如下：

1.3.7 方法的檢出限與定量限

以標準曲線最低點工作液稀釋10倍后上機分析，以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限[25]，以信噪比為10（S/N=10）計算定量限[26]。

1.3.8 方法的加標回收率與精密度試驗

選取空白獼猴桃樣品基質(zhì)進行加標回收試驗，分別準確添加5 μg/kg、50 μg/kg和100 μg/kg的3個水平濃度的15種有機磷農(nóng)藥混合標準溶液，按照1.3.1 QuEChERS前處理，每個添加水平做6次重復(fù)試驗，計算其加標回收率、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)氧七氯內(nèi)標及15種有機磷農(nóng)藥混標溶液GC-MS分析總離子流色譜圖

環(huán)氧七氯內(nèi)標及15種混合農(nóng)藥標準品、獼猴桃樣品中環(huán)氧七氯及15種混合農(nóng)藥的GC-MS分析總離子流色譜圖（total ions chromatogram，TIC）見圖1。

圖1 環(huán)氧七氯及15種農(nóng)藥標準品（A）、獼猴桃樣品中環(huán)氧七氯及15種農(nóng)藥（B）的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 1 Total iron chromatogram of heptachlor epoxy and 15 pesticides standards (A),heptachlor epoxy and 15 pesticides in kiwifruit samples (B) analyzed by GC-MS

2.2 提取溶劑的選擇

不同提取溶劑對15種農(nóng)藥回收率的影響見圖2。由圖2可知，以乙腈、二氯甲烷、乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）分別作為QuEChERS法萃取溶劑時，其平均回收率分別是83.91%、86.72%、91.93%，均滿足農(nóng)藥殘留痕量分析要求。研究表明，二氯甲烷毒性相對較大，長期接觸不利于實驗人員的健康；單一溶劑乙腈提取效果沒有混合溶劑乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取效果好，所以選擇乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為QuEChERS前處理法的提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對15種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on recovery rate of 15 pesticides

2.3 凈化方法的選擇

不同凈化方法對15種農(nóng)藥回收率的影響見圖3。由圖3可知，隨著凈化劑用量的增加，獼猴桃中15種農(nóng)藥的回收率逐漸增大，其中A組、B組、C組的平均回收率分別為84.85%、87.47%、93.63%，且C組凈化樣品溶液越清澈，對儀器色譜柱及離子源污染較小，所以選擇C組（100 mg PSA+200 mg C18+40 mg GCB+300 mg無水MgSO4）的凈化劑配比進行樣品凈化。

圖3 不同凈化方法對15種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 3 Effect of different purification methods on recovery rate of 15 pesticides

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

15種農(nóng)藥在獼猴桃中的基質(zhì)效應(yīng)見表2。由表2可知，基質(zhì)效應(yīng)對治螟磷、益棉磷、丙溴磷、除線磷、毒死蜱分析結(jié)果影響較小，但對其他農(nóng)藥分析結(jié)果存在基質(zhì)抑制或增強效應(yīng)，為了避免基質(zhì)效應(yīng)對農(nóng)藥分析結(jié)果產(chǎn)生影響，試驗中可采用空白基質(zhì)溶液匹配標準曲線，加入分析保護劑、鹽析等方法降低基質(zhì)效應(yīng)對試驗結(jié)果的影響[27-28]。本試驗采用基質(zhì)匹配標準曲線法降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 15種農(nóng)藥在獼猴桃中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of 15 pesticides in kiwifruit

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法的線性回歸方程、檢出限及定量限

15種農(nóng)藥的標準曲線的線性回歸方程、檢出限及定量限見表3。由表3可知，15種農(nóng)藥在質(zhì)量濃度0.05～1.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.998，方法檢出限為0.001 2～0.326 5 μg/kg；方法定量限為0.004～1.088 μg/kg。符合GB/T27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》及農(nóng)業(yè)部公告2386號《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標準編制指南》中相應(yīng)參數(shù)要求，表明所建立的檢測方法科學(xué)可行，可用于實際樣品的檢測。

表3 15種農(nóng)藥的線性回歸方程、檢出限及定量限Table 3 Linear regression equation,detection limit and quantification limit of 15 pesticides

2.5.2 方法加標回收率及精密度試驗結(jié)果

由表4可知，空白獼猴桃樣品中15種農(nóng)藥的平均加標回收率為76.95%～101.2%，精密度試驗結(jié)果相對標準偏差（RSD）為0.21%～10.05%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》痕量殘留分析要求。

表4 加標回收率及精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 4 Results of spiked recovery rate and precision tests (n=6)

續(xù)表

2.6 獼猴桃樣品的檢測結(jié)果

以上述建立的方法檢測20份市售獼猴桃中的15種農(nóng)藥殘留，結(jié)果見表5。由表5可知，共有15個獼猴桃樣品中檢出了14種農(nóng)藥殘留。根據(jù)國標GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定農(nóng)藥最大殘留限量（maximum residue limits，MRLs）對檢測結(jié)果進行判定。15種農(nóng)藥殘留中，有10種農(nóng)藥在國標GB 2763—2021中有農(nóng)藥最大殘留限量值的相應(yīng)規(guī)定，這10種農(nóng)藥雖在不同獼猴桃樣品中有檢出呈陽性，但其值均未超過相應(yīng)國標規(guī)定最大殘留限量值（MRLs）；剩余5種農(nóng)藥未有最大殘留限量值（MRLs）規(guī)定的農(nóng)藥品種不作判斷。其中苯硫磷在20份獼猴桃樣品均未檢出。

表5 獼猴桃樣品中15種農(nóng)藥的檢測結(jié)果Table 5 Determination results of 15 pesticides in kiwifruit samples

3 結(jié)論

本研究以獼猴桃為檢測對象，建立了改良QuEChERS法結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法快速檢測獼猴桃中15種有機磷農(nóng)藥殘留的分析檢測方法，通過對試驗條件的選擇和優(yōu)化，最終采用乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為提取溶劑，凈化條件為100 mg PSA+200 mg C18+40 mg GCB+300 mg無水MgSO4（C組），空白基質(zhì)配標，保留時間、特征離子及其相對豐度定性，內(nèi)標法定量。在此優(yōu)化前處理條件下，其平均加標回收率為76.95%～101.2%，精密度試驗結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為0.21%～10.05%，方法檢出限為0.001 2～0.326 5 μg/kg，定量限為0.004～1.088 μg/kg。該方法具有凈化效果好、重復(fù)性強、靈敏度高等優(yōu)勢，在分析獼猴桃等復(fù)雜樣品時，能有效消除基質(zhì)干擾，減少假陽性的檢出率，簡化樣品的前處理，降低分析成本，可以滿足批量獼猴桃樣品中多農(nóng)藥殘留檢測的要求。