微生物混合感染性角膜炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展

李玉婷，李 妍，王 嵐，胡竹林

references for the further development and research of animal models of the disease.

0引言

微生物角膜炎(microbial keratitis,MK)是細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲或多種感染因子混合感染人或哺乳類動(dòng)物眼部引起創(chuàng)傷或感染的角膜疾病[1]。MK是單側(cè)角膜失明的重要原因之一[2]，在熱帶地區(qū)，真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK) 約占所有MK的40%[3]，我國FK的致病菌主要為兩種，分別是鐮刀菌屬(25.5%)和曲霉菌屬(10.3%)[4]；而在溫帶地區(qū)，細(xì)菌性角膜炎(bacterial keratitis,BK)更為常見[5]，致病菌中比例最大的是表皮葡萄球菌占34.5%，其次是肺炎鏈球菌占13%，最后是金黃色葡萄球菌占10.2%等[6]。由兩種以上微生物引起的角膜混合感染相對(duì)少見，其可能是合并感染，也可能是繼發(fā)于現(xiàn)有微生物的二次感染。最近一份關(guān)于角膜感染的報(bào)告指出，存在混合感染的現(xiàn)象，細(xì)菌和真菌混合感染的比例占1.9%，而細(xì)菌和棘阿米巴原蟲的混合感染要更多一些，占比為15.8%[7]。另外，一些病例報(bào)告里面，對(duì)于不同種的細(xì)菌和真菌，分別進(jìn)行了混合感染的相關(guān)介紹，例如表皮葡萄球菌和鐮刀菌屬[8]、真菌和革蘭陽性球菌[9]、假單胞菌和煙曲霉菌[10]等。混合感染性角膜炎引起的角膜炎癥會(huì)損害角膜上皮和角膜深層，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起角膜穿孔[11]，進(jìn)一步導(dǎo)致視力下降，甚至視力喪失，有的患者需要摘除眼球或剜除眼內(nèi)容物，才能防止病變進(jìn)一步擴(kuò)散至全身，因此，及時(shí)有效地治療對(duì)控制病變的發(fā)展十分重要。由于混合感染性角膜炎的病理機(jī)制尚不明確，建立動(dòng)物模型對(duì)于探索其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。與此同時(shí)，動(dòng)物模型的建立也有助于該病的預(yù)防、診斷和治療等。本文對(duì)近年來國內(nèi)外微生物混合感染性角膜炎動(dòng)物疾病模型制備方法進(jìn)行總結(jié)。

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

在醫(yī)學(xué)研究方面，建立動(dòng)物模型是非常有必要的，可以幫助人類對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)測(cè)、預(yù)防，進(jìn)而提前進(jìn)行干預(yù)、治療，控制疾病的發(fā)生發(fā)展。因此在研究許多重大疾病的時(shí)候，需要建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，但缺乏合適的動(dòng)物模型一直是全球各個(gè)國家關(guān)注并需要攻克的難題，人們也在不斷建立和完善各類疾病動(dòng)物模型[12]。建立模型的時(shí)候，對(duì)于動(dòng)物的挑選，需要根據(jù)菌種的相關(guān)特征及實(shí)驗(yàn)需求，找到最為合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

目前研究中使用的動(dòng)物主要有兔、鼠、猴[13]。與人類的角膜相比，兔角膜要更大一些，易于手術(shù)操作，在手術(shù)過程中及術(shù)后，也可以更細(xì)致的觀察到角膜局部的變化，而且兔的結(jié)膜是紅色的，其前房出現(xiàn)的纖維蛋白更容易被發(fā)現(xiàn)、觀察；同時(shí)，可以獲得較多的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，還可以獲得更多具有實(shí)用性的疾病參數(shù)，兔子中有兩個(gè)國家的品種使用較為廣泛，一個(gè)是新西蘭的白兔，一個(gè)是荷蘭的帶紋兔[14-15]。但從免疫學(xué)觀點(diǎn)看，實(shí)驗(yàn)用兔并不是完全沒有缺點(diǎn)的，存在一定的局限性，它的繁殖發(fā)生在較為親近的群體當(dāng)中，存在組織相容性，由于不是近交系動(dòng)物，很難確定其免疫遺傳背景[16]，這些都會(huì)給實(shí)驗(yàn)造成不確定性和穩(wěn)定性差。小鼠的角膜與人類相比較小，無論是在手術(shù)操作方面，還是在取材方面，都沒有兔眼簡(jiǎn)便，而且不利于微生物混合感染大體形態(tài)學(xué)的觀察。雖然小鼠缺陷很明顯，但也不能忽視它的優(yōu)勢(shì)。因?yàn)樾∈蟛粌H具有較多的近交系品系，還具有較多的遠(yuǎn)交系品系，特別是近年來廣為人知的轉(zhuǎn)基因研究，轉(zhuǎn)基因后獲得的小鼠，可以對(duì)一些特殊因子進(jìn)行針對(duì)性分析，同時(shí)提供生物制劑，除了BALB/c小鼠外，還有C57BL/6品系小鼠，它們都是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到的品系類型。兩類小鼠進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，第一類小鼠更加敏感一些，針對(duì)細(xì)菌感染的程度更高[17]，實(shí)驗(yàn)上更為常用。猴屬于靈長類動(dòng)物，猴眼的各層組織結(jié)構(gòu)特別是角膜，與人眼極其相似，實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)，用猴子造模能更好地模擬疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[18]。但是因?yàn)楹镒觾r(jià)格昂貴，在實(shí)際工作中操作不便，不能進(jìn)行大規(guī)模、大批量的實(shí)驗(yàn)，也不能獲得較多的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，故猴子造模應(yīng)用較少。近年來，樹鼩(tree shrew)模型越來越得到人們的關(guān)注。樹鼩不僅體型小、生殖周期短、壽命短，飼養(yǎng)成本也低，是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中最有望替代靈長類動(dòng)物的一類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[19]。樹鼩角膜大小適中，角膜各層結(jié)構(gòu)和人類角膜較相似[20]，而且與嚙齒類相比，與人類親緣關(guān)系更近[21]，作為造模動(dòng)物來說，是角膜疾病較為理想的造模動(dòng)物。但樹鼩研究歷史較短，無特異性抗體，缺乏特異性強(qiáng)的診斷試劑，因此其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性、可靠性不高，還有待進(jìn)一步研究。其他還有用豚鼠、貓等動(dòng)物作為模型。

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物大多數(shù)為近親交配，這與遠(yuǎn)系繁殖的人類就有較大差異。另外根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同，在解剖上也存在不同的特征，其他還包括組織成分、功能組件的差別，如人的角膜直徑大約為11～12mm，而兔的角膜直徑為13mm，鼠的角膜直徑2.2～3.5mm，樹鼩則為8～9mm[22-23]，四者進(jìn)行對(duì)比，人類的角膜厚度最厚，眨眼間隔時(shí)間較短，只有2.8s，但兔子和小鼠的眨眼間隔時(shí)間，是人類的10倍不止，達(dá)到30s；另外，只有兔子眼表有一層瞬膜，而人類沒有，這會(huì)造成眼表觀察時(shí)的各種差異[24]。所以，不管動(dòng)物在某些方面的特征與人類有多么相近，依然不能完全替代人類，實(shí)驗(yàn)造模的時(shí)候還是存在差異。選擇好適合的動(dòng)物類型后，需要先適應(yīng)性飼養(yǎng)7d左右，使用放大鏡或手電筒檢查動(dòng)物雙眼是否存在眼疾，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)候，需要給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定的關(guān)愛，且不違背動(dòng)物倫理[25]。

2菌株的選擇

建立混合感染性角膜炎動(dòng)物模型要根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果或?qū)嶒?yàn)要求，選擇臨床常見混合感染菌種，以便動(dòng)物模型能廣泛應(yīng)用于臨床，促進(jìn)臨床混合感染性角膜炎的防治進(jìn)展。

細(xì)菌和真菌是角膜混合感染最常見的類型。被報(bào)道較多的有葡萄球菌屬、曲霉菌屬及鐮刀菌屬[3, 26-28]。許多疾病中都描述了細(xì)菌與真菌之間的相互作用，包括真菌和革蘭氏陽性菌，如戈登鏈球菌和白色念珠菌[29]、金黃色葡萄球菌與新型隱球菌[30]以及金黃色葡萄球菌和煙曲霉[31]。其中，Granillo等[31]在研究中發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在混合生物膜中抑制了煙曲霉的生長。最近一份關(guān)于感染性角膜炎的報(bào)告指出，在所有3183例病例中，有2.39%的病例為細(xì)菌和真菌混合感染[32]。Ahn等[8]進(jìn)行了一項(xiàng)歷時(shí)8a(2000/2007年)的關(guān)于細(xì)菌和真菌性混合感染角膜炎的回顧性研究，報(bào)告稱混合感染最常見的微生物組合是鐮刀菌(fusarium)和表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)占39%。革蘭氏陽性菌在細(xì)菌中最常見(占細(xì)菌培養(yǎng)總數(shù)的79%)，其中表皮葡萄球菌占比最大，達(dá)到了45%，其次是草綠色鏈球菌(streptococcus viridans)占11%。真菌中，絲狀真菌(filamentous fungi)占主導(dǎo)地位(占所有真菌培養(yǎng)物的 79%)，其中最常見的是鐮刀菌屬占56%，其次是念珠菌種(candida)占12%。結(jié)合以往的病例報(bào)道發(fā)現(xiàn)，臨床上細(xì)菌真菌混合感染較為常見，但是在建立FK動(dòng)物模型時(shí)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物普遍對(duì)真菌不易感，常常需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫抑制，而免疫抑制會(huì)加重細(xì)菌的感染，因此免疫抑制可能會(huì)對(duì)建立細(xì)菌真菌混合感染動(dòng)物模型產(chǎn)生一定影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果除了具有真實(shí)可靠性以外，還需要具備可重復(fù)性，進(jìn)行動(dòng)物模型制作時(shí)，盡可能選用權(quán)威微生物種保存機(jī)構(gòu)(如American Tissue Culture Collection，ATCC；中國科學(xué)院微生物研究所等)保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株，最好選用臨床混合感染性角膜炎患者的分離標(biāo)本。

3操作方法

3.1菌液配制在實(shí)驗(yàn)開始前24h或48h，將菌種接種于營養(yǎng)瓊脂斜面進(jìn)行活化，細(xì)菌菌株如化膿性鏈球菌，接種于血瓊脂培養(yǎng)基[33]，如果是大腸埃希菌，接種于中國藍(lán)培養(yǎng)基[34]，37℃下恒溫培養(yǎng)1～2d；真菌菌株一般接種于沙保氏培養(yǎng)基(sabouraud dextrosee agar，SDA)或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato extrose agar，PDA)30℃溫度或室溫條件下培養(yǎng)72h；挑取生長良好的菌落振蕩培養(yǎng)，配制微生物混懸液。細(xì)菌濃度大多數(shù)情況下為1×108～1×1010CFU/mL[35]；關(guān)于真菌菌液濃度，國內(nèi)外報(bào)道的結(jié)果不一，濃度從106～1010CFU/mL不等[36-38]。Wu等[39]利用鼠制作真菌感染模型的過程中發(fā)現(xiàn)，角膜上皮損傷后，真菌接種至少需要102CFU/mL才能引起角膜感染；隨著菌液濃度的增加，角膜的感染成功率提高，而一次接種達(dá)到106CFU/mL就足以使所有角膜感染真菌。

菌液配制并不是統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，需要根據(jù)微生物的具體功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，選擇羊血瓊脂培養(yǎng)基，還要加入5% CO2[40]。不同菌種間毒力、致病性有所區(qū)別，且存在相互拮抗抑制的可能，混合感染時(shí)不同菌液的濃度選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。

3.2微生物接種方法

3.2.1角膜表面劃痕法二十世紀(jì)七十年代初期，Gerke等[41]首次提出用角膜表面劃痕法通過小鼠制作綠膿桿菌模型，此方法一經(jīng)推出，就獲得了眾多學(xué)者的支持和嘗試。該方法在不劃破基質(zhì)侵入前房的前提下，使用無菌25～30G注射針頭在角膜表面劃出長度為1mm左右的3～5道平行的傷口，選擇吸液管將菌液(一般為5μL)接種于小鼠的角膜表面[42-43]。此方法優(yōu)點(diǎn)：易于操作，感染需要的時(shí)間較短，同時(shí)對(duì)于病原微生物和角膜傷口而言，可以促進(jìn)它們之間的相互作用；缺點(diǎn)：感染率偏低。另外菌液流動(dòng)性較好，較早滴加的菌液可快速彌散于受損角膜，可能對(duì)后滴加的菌種造成影響，降低后者的侵襲性。因此，此方法需進(jìn)行改進(jìn)，例如進(jìn)一步明確所接種病原微生物的種類以及固定或麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的時(shí)間，以增加病原微生物的感染率。

3.2.2基質(zhì)內(nèi)注射法到了二十世紀(jì)七十年代中后期，Kupferman等[44]提出了角膜基質(zhì)內(nèi)注射模型。用微量注射器定量抽取適量(一般為5μL)的菌液，選擇角膜近中心處進(jìn)針，針尖進(jìn)入至角膜實(shí)質(zhì)層下1/3，形成白色菌斑，直徑范圍在5～6mm。優(yōu)點(diǎn)：該方法操作方便，具有良好的重復(fù)性。對(duì)于感染具有難度的菌株，例如真菌感染，也能起到相應(yīng)的效果，具有較高的感染率；缺點(diǎn)：此方法的感染過程在一定程度上破壞了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物角膜的正常結(jié)構(gòu)，與人角膜自然感染過程存在較大差異，所以此法更多是用來判斷角膜炎藥物療效和探究診斷方法。

3.2.3角膜接觸鏡法隨著配戴隱形眼鏡的人數(shù)不斷增多，角膜接觸鏡引發(fā)的角膜感染也越來越常見，學(xué)者們結(jié)合角膜表面劃痕法，提出了角膜接觸鏡法。即對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角膜直徑進(jìn)行標(biāo)記，使用角膜環(huán)鉆，將上皮去除，戴上角膜接觸鏡，并滴入適量菌液，或在培養(yǎng)基上將角膜接觸鏡與適當(dāng)濃度(多為108CFU/mL)菌液一同培養(yǎng)24h，溫度保持在30℃，然后戴在損傷角膜表面。縫閉眼瞼，完成接種后的48h，再拆除縫線，用裂隙燈進(jìn)行觀察。有關(guān)研究表明，低氧性損傷是發(fā)生感染的前提，隱形眼鏡相關(guān)角膜感染最有可能是由于低氧透接觸鏡導(dǎo)致的[45]。所以，在建立模型的時(shí)候，如果想將角膜感染率提高，可以通過建立缺氧模型來實(shí)現(xiàn)。此方法的優(yōu)勢(shì)為：將病原微生物感染角膜的過程盡可能地進(jìn)行了模擬和還原，不僅提高了感染率，還能對(duì)發(fā)病過程及機(jī)制進(jìn)行研究；缺陷則是操作具有一定的難度，需要更多的時(shí)間，對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉時(shí)間及實(shí)驗(yàn)操作人員，有比較嚴(yán)格的要求。

3.2.4“微口袋”法為了建立混合感染模型，Ponce-Angulo等[46]采用了一種稱為“微口袋”的新技術(shù)，他們使用的方法是在接種金黃色葡萄球菌及鐮刀菌前，預(yù)先用環(huán)磷酰胺和甲基強(qiáng)的松龍聯(lián)合處理實(shí)驗(yàn)用小鼠(分別于接種前5、3、1d肌內(nèi)注射80mg/kg甲基強(qiáng)的松龍及150mg/kg環(huán)磷酰胺)，制造出免疫低下的動(dòng)物模型。每個(gè)微口袋的長度為2mm，用針頭在角鞏膜緣制造一個(gè)病變，操作時(shí)要小心謹(jǐn)慎，以免角膜穿孔和改變眼睛的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，將細(xì)菌和真菌細(xì)胞以相同濃度1×105CFU/mL同時(shí)接種到角膜組織中，閉合動(dòng)物瞼裂幾秒鐘，保證角膜里面菌液的分布是均勻的。針刺的程度不一，會(huì)造成不同程度的創(chuàng)傷，傷及角膜基質(zhì)可能會(huì)影響混合感染的自然病程，不同個(gè)體間的感染病變也可能因?yàn)閯?chuàng)傷程度不同而變化，使動(dòng)物模型的穩(wěn)定性不佳，此法還有待進(jìn)一步的研究。

4感染成功后的鑒定方法

造模后需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行診斷及鑒定診斷，看角膜是否有微生物感染，是單一菌種感染還是混合感染；同時(shí)還需要鑒定感染病原菌，確定是哪種病原微生物導(dǎo)致的感染。

4.1病原學(xué)培養(yǎng)檢測(cè)對(duì)于感染性角膜炎來說，微生物學(xué)是主要診斷方法，臨床上常用的基本診斷工具依次有：涂片、培養(yǎng)和敏感性測(cè)定，是檢測(cè)角膜感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”[47]。主要目的是對(duì)真菌、細(xì)菌及阿米巴原蟲進(jìn)行分離、培養(yǎng)及鑒定。不同菌種檢測(cè)操作方法如下：(1)馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基的真菌培養(yǎng)：標(biāo)本接種后，待菌落生長，利用膠帶法和小培養(yǎng)法，對(duì)真菌種屬進(jìn)行鑒定。(2)血平板、巧克力平板的細(xì)菌培養(yǎng)：標(biāo)本接種于兩種平板后，放在營養(yǎng)肉湯中，等待細(xì)菌增長，任意兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性后，分離出單個(gè)菌落，然后鑒定出細(xì)菌的種類。(3)阿米巴培養(yǎng)：標(biāo)本接種后，添加50μL大腸桿菌菌液共同培養(yǎng)，利用斜面鏡觀察，找到阿米巴滋養(yǎng)體或者包囊為陽性。

平板培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn):可選擇混合感染的菌種適宜的平板,刮取角膜組織進(jìn)行平板培養(yǎng)后，可在平板上觀察到不同的微生物生長，是較為直觀的鑒別方法，同時(shí)可進(jìn)一步分離純化菌種進(jìn)行鑒定。但由于混合感染的病原菌生長周期各不相同，如細(xì)菌真菌混合感染，細(xì)菌生長相對(duì)較快，真菌生長相對(duì)緩慢，培養(yǎng)時(shí)長增加等因素，會(huì)影響平板培養(yǎng)的陽性檢出率。

4.2角膜涂片染色細(xì)胞學(xué)檢查首先，取材部位為動(dòng)物模型角膜病灶處，及時(shí)涂片，使用甲醇原液進(jìn)行固定，時(shí)間一般為60～120s，然后用稀釋吉姆薩染液染色后直接鏡檢，經(jīng)濟(jì)快捷、可反復(fù)操作、準(zhǔn)確率高，并可鏡下直接檢測(cè)有無真菌或細(xì)菌感染，協(xié)助早期確定診斷，目前是我國快速診斷感染性角膜炎的主要檢測(cè)技術(shù)[48]。除了以上染色方法，還可以選擇熒光染液對(duì)真菌進(jìn)行熒光染色檢測(cè)，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌的長絲狀藍(lán)色或者藍(lán)紫色高亮熒光[49]。

該法方便快捷，可以迅速對(duì)感染性角膜炎做出診斷；但當(dāng)取材部位不準(zhǔn)確或有所遺漏時(shí)，涂片也會(huì)呈假陰性結(jié)果。因此，需要掌握正確的取材方法，注意刮取不同的角膜病灶處，進(jìn)行染色、鏡檢、觀察。

4.3角膜激光共焦顯微鏡檢查麻醉或處死動(dòng)物后，將激光掃描攝像頭的位置調(diào)節(jié)好，使激光光束位于角膜病變區(qū)域。利用非連續(xù)手動(dòng)掃描模式，對(duì)病灶區(qū)進(jìn)行掃描。優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)感染性角膜炎的病原體影像如真菌菌絲，阿米巴包囊、空囊、滋養(yǎng)體，快速進(jìn)行診斷[50]。但是共焦顯微鏡屬于形態(tài)學(xué)檢測(cè)[51]，大部分感染性角膜炎在共聚焦顯微鏡下的主要特征是出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，因此若是細(xì)菌混合感染，或真菌、阿米巴感染癥狀不典型，則無法區(qū)分。

4.416SrRNA基因序列分析法提取病原菌的DNA，采用通過引物經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因片段，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。此方法特異性高，可以用于感染性角膜炎檢測(cè)尤其是不清楚感染病原菌及排除其他病原菌同時(shí)感染的情況[52]。

但是混合感染若不進(jìn)行純化，擴(kuò)增時(shí)不同菌種的引物不同，可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或?qū)е妈b定錯(cuò)誤。同一菌種采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果出現(xiàn)雙峰，對(duì)鑒定結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生影響。為了避免鑒定失敗，可先將菌種平板培養(yǎng)后分離純化，再進(jìn)行測(cè)序，或進(jìn)行高通量測(cè)序。

5小結(jié)

綜上所述，微生物混合感染性角膜炎逐漸增多，嚴(yán)重威脅著人類的眼部健康，必須給予重視。為了更好地研究人類微生物混合感染性角膜炎的發(fā)病機(jī)制，就需要掌握一系列感染成功率高、疾病發(fā)生發(fā)展過程與人角膜混合感染的過程相似、一致性強(qiáng)的動(dòng)物模型制作的方法。但目前存在較多的問題和困難，需要進(jìn)一步的嘗試和克服，以保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的成果客觀、可信、可重復(fù)，能夠?yàn)樘剿髟摬〉陌l(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)臨床提供重要的基礎(chǔ)，降低其致盲率，為感染性眼科疾病做出巨大貢獻(xiàn)，并讓研究能夠更進(jìn)一步。