環(huán)狀RNA在眼部疾病中的研究進展

鄒麗榮，王欣玲

0引言

長久以來，非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)一直在基因組學上扮演著“垃圾冗余”的角色，直到2001年人類基因組測序技術的出現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)，基因組中只有2%基因編碼蛋白質，其余則只轉錄成RNA，不再繼續(xù)翻譯成蛋白質。有趣的是，在較低等的生物中編碼蛋白的基因比例很高，ncRNA比例較低;高等生物則相反，如人類基因組中ncRNA比例高達98%，證實了進化的水平和ncRNA息息相關，進一步的研究揭示了ncRNA在轉錄和轉錄后水平調控基因表達方面的重要功能。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類具有共價閉環(huán)結構的ncRNA，主要類型包括外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA，其中外顯子circRNA是由mRNA前體(pre-mRNA)通過反向剪接進行處理，以3’-5’磷酸二酯鍵的方式形成環(huán)狀結構，無5’的帽子結構和3’的多聚腺苷酸尾結構。與同源線性RNA相比，circRNA不易被核酸外切酶(Ribonuclease R, RNase R)分解，具有更穩(wěn)定的功能與性質，在疾病病理方面有巨大潛在的作用。目前研究中最為經(jīng)典的功能是充當微小RNA(microRNA,miRNA)海綿，其次還有翻譯蛋白質、與RNA結合蛋白結合和調控表觀遺傳學等。circRNA在眼科領域[1]展現(xiàn)了其獨有的特性，半衰期長且豐度高，多在細胞質及外泌體中富集，且具有進化保守性，為其穩(wěn)定發(fā)揮生物學功能奠定基礎。本文就近年來circRNA在眼部疾病中的研究進展進行綜述。

1 circRNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變

研究表明，至2030年，糖尿病可能成為人類的第七位主要死因[2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，會導致視力喪失甚至失明。研究人員通過對DR患者和對照受試者的血液[3]及玻璃體液[4]等體液樣本進行表達譜測序分析，鑒定差異基因后尋找與miRNA的相互作用關系，構建基于候選circRNA的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡從而驗證了circRNA有望成為DR的新型診斷標志物和治療靶標?；さ脑龊?、周細胞的丟失、內皮細胞的增生、微血管瘤及新生血管的形成是DR主要的病理改變。越來越多的DR相關研究表明，circRNA參與周細胞和內皮細胞(endothelial cell，ECs)的調節(jié)。Jiang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-ZNF532調節(jié)糖尿病誘導的視網(wǎng)膜周細胞變性和血管功能障礙。Wei等[6]發(fā)現(xiàn)在高糖誘導的ECs凋亡中circVEGFC上調，通過circVEGFC/miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA軸發(fā)揮促進作用，為糖尿病的ECs損傷提供潛在的治療策略。

眾所周知，視網(wǎng)膜血管細胞主要包括周細胞和ECs，二者的正常串擾對視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)起著至關重要的作用，而異常串擾則可導致血管滲漏和新生血管形成等嚴重病變。Liu等[7]揭示了糖尿病微血管異常的機制，主要涉及周細胞上cPWWP2A、miR-579和angiopoietin1/occludin/SIRT1的相互調控。體外研究表明，cPWWP2A通過直接作用調控周細胞生物活性，而通過攜帶cPWWP2A外泌體的間接作用調控ECs生物活性。在此基礎上研究者進一步[8]構建了低氧周細胞與高糖誘導下ECs的共培養(yǎng)模型，探討周細胞和ECs的串擾作用對視網(wǎng)膜血管的影響，circEhmt1在周細胞中被上調，隨后通過外泌體從周細胞轉移到ECs，circEhmt1介導的NFIA/NLRP3途徑在周細胞外泌體中激活HIF信號通路可能是影響皮內血管生成的周細胞-ECs串擾的關鍵機制，為DR的發(fā)病機制及治療提供了新的見解。

2 circRNA與青光眼

青光眼(glaucoma)是一組與眼壓相關的、視神經(jīng)進行性萎縮和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGCs)喪失為標志的一組病理性疾病，是世界范圍內引起視力喪失和不可逆性失明的主要原因。對于青光眼的發(fā)病機制以及治療方法一直處于探索過程中。circRNA已被證明與諸多神經(jīng)退行性疾病有關[9]，如帕金森病[10]、肌萎縮性側索硬化[11]、阿爾茲海默癥[12]等。青光眼被認為是視網(wǎng)膜的神經(jīng)退行性疾病，故circRNA與青光眼之間的關系一直處于熱點狀態(tài)。Wang等[13]通過微珠注射法制作大鼠青光眼模型，評估了cZRANB1在體內和體外的表達情況,以及與RGCs和視網(wǎng)膜反應性膠質細胞(如Müller細胞等)的相互作用關系。研究發(fā)現(xiàn)，cZRANB1可在體外直接促進Müller細胞的活力而間接調控RGCs細胞的功能，在體內促進Müller細胞的增生及激活。同時發(fā)現(xiàn)，通過激活cZRANB1/miR-217/RUNX2通路來調節(jié)Müller細胞的功能進而影響RGCs。原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是最常見的青光眼類型，Shen等[14]篩選了在氧化應激條件下人小梁網(wǎng)細胞(human trabecular meshwork cells，HTMCs)中差異表達的circRNA(命名為circHBEGF)，circHBEGF在調節(jié)HTMCs中的miR-646/EGFR信號傳導及對促進細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的產(chǎn)生起到了關鍵作用。這一發(fā)現(xiàn)使我們對POAG的發(fā)病機制有了進一步理解，候選circRNA及其下游信號可作為治療POAG患者的新靶標。

3 circRNA與白內障

白內障(cataract)以晶狀體混濁為特征，是世界范圍內首位致盲性眼病。年齡相關性白內障(age-related cataract，ARC)是白內障最常見的類型，但ARC的確切病因及發(fā)病機制尚不清晰。紫外線B (UVB)輻射[15]誘導的晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)的DNA雙鏈斷裂被認為是ARC形成的重要原因之一。人毛細血管擴張性共濟失調突變基因(ATM)在多個研究中[16-17]被證明其與衰老的關系，ATM的過度激活廣泛地促進了多種年齡相關疾病的發(fā)生。Liu等[18]研究表明circMRE11A作為UBXN1的支架，通過ATM/p53/p21信號通路從而誘導ATM過度激活，促進LECs衰老。此研究還構建了circMRE11A-AAV2，并注射至癌癥研究所(Institute of Cancer Research, ICR)小鼠玻璃體腔內，進一步證明circMRE11A-AAV2可進入ICR小鼠晶狀體的LECs并表達，以此來更好的理解ARC的病理，進一步尋找新的、更有效的治療靶點。手術治療是目前為止白內障最主要的治療方式，而后囊膜混濁(posterior capsular opacification, PCO)是白內障術后視力障礙的主要并發(fā)癥，上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是PCO的主要特征，TGF-β2能顯著誘導EMT過程，建立體外PCO模型[19]。Liu等[20]使用TGF-β2刺激人晶狀體上皮細胞系(SAR01/04)細胞，建立PCO細胞模型，Circ-CARD6在PCO組織中上調，且可海綿化miR-31調節(jié)TGF-β2處理的SRA01/04細胞中FGF7的表達。Circ-CARD6基因敲低可抑制細胞增殖、轉移和EMT過程，而anti-miR-31可逆轉這一過程，此研究為circ-CARD6有助于PCO的分子靶向治療提供有力證據(jù)。目前為止，已有諸多研究證實circRNA為預防和治療ARC提供潛在靶點，但circRNA在ARC中的表達譜、調控作用和潛在機制等方面，很大程度上仍然未知。

4 circRNA與年齡相關性黃斑變性

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是全球老年人失明的主要原因，該疾病主要影響視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)和脈絡膜毛細血管。ARMD分為兩種類型：萎縮性ARMD和滲出性ARMD。萎縮性ARMD的特征為RPE、脈絡膜毛細血管和光感受器的萎縮。RPE分泌多種對視網(wǎng)膜和脈絡膜起著關鍵作用的生長因子和細胞因子[21]，并維持光感受器的存活與功能，因此RPE的正常功能是ARMD的核心驅動因素。研究發(fā)現(xiàn)circNR3C1在體內和體外均能保護正常的RPE功能并阻止ARMD的進展，circNR3C1通過充當miR-382-5p海綿和PTEN/AKT/mTOR信號通路調節(jié)劑來預防ARMD，成為萎縮性ARMD有希望的治療選擇[22]。滲出性ARMD的特征為脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成，導致中心視力迅速惡化。血管ECs的活化產(chǎn)生多種血管生成相關因子，通過布魯赫膜(Bruch膜)和RPE層遷移和增殖，最終導致CNV的形成。Liu等[23]證實CNV小鼠和對照組小鼠的circRNA存在顯著差異，表明circRNA在CNV的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。Zhou等[24]又進一步揭示了cZBTB44的沉默抑制CNV的發(fā)展并抑制ECs的增殖遷移和管形成，cZBTB44作為內源性海綿通過結合miR-578并抑制其活性，導致血管內皮生長因子A(VEGFA)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)表達增加，為了解CNV的發(fā)病機制提供了新的見解。衰老是該病重要的危險因素，circRNA的高穩(wěn)定性導致其在衰老和年齡相關疾病方面也有較深的研究[25]，為circRNA是診斷和治療ARMD的潛在靶標提供了有力的證據(jù)。

5 circRNA與眼部腫瘤

circRNA在全身腫瘤方面的研究一直是熱點狀態(tài)[26]，多項研究證明其可調節(jié)和控制人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。針對circRNA在眼部腫瘤的近期研究，總結如下。

5.1視網(wǎng)膜母細胞瘤視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma, RB)是一種最常見的小兒惡性腫瘤，占所有兒童期惡性腫瘤的3%。多項研究表明，circRNAs在RB的發(fā)育中起著重要的作用。Lyu等[27]首次報道人RB組織中circRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)差異表達的circRNA宿主基因主要參與染色質修飾，這是一種可以通過誘導表觀遺傳學、轉錄組學和表型改變從而促進腫瘤發(fā)生的生物學過程。TET1-has_circ_0093996和程序性細胞死亡因子4(PDCD4)在RB組織中顯著下調，綜合數(shù)據(jù)和生物信息學分析TET1-has_circ_0093996的下調可能增加未結合的miR-183，從而降低PDCD4的表達，構建了一個完整的假定調節(jié)軸即TET1-has_circ_0093996-miR-183-PDCD4軸，為染色質修飾和RB發(fā)病機制提供了一個獨特視角。但該研究中的假定調節(jié)軸仍需進一步驗證。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RB組織和細胞表現(xiàn)出更高水平的circDHDDS，circDHDDS 的沉默抑制了細胞生長、遷移和侵襲，促進了RB 細胞中G0/G1的細胞周期停滯。該研究進一步認為circDHDDS可能通過circDHDDS/miR-361-3p/WNT3A軸對RB的發(fā)生發(fā)展進行調控。S相激酶相關蛋白-2(SKP2)在諸多癌癥中作為致癌基因已被揭露[29]，Du等[30]研究了SKP2蛋白在RB中的分子機制，通過生物信息學預測及證明，circ_ODC1和miR-422a誘導的SKP2促進RB增殖，此發(fā)現(xiàn)為RB提供新的預后標志物和治療靶標。目前，RB的臨床診斷仍需要侵入性操作，這可能會促進腫瘤細胞擴散。circRNA廣泛且穩(wěn)定的存在于外泌體、血液、淚液等體液中，且被證實可以參與RB發(fā)生中的染色質修飾，為染色質狀態(tài)改變提供重要線索。有望成為更好地、無創(chuàng)地診斷RB和RB預后評估的方法。

5.2葡萄膜黑色素瘤葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是一種成人最常見的原發(fā)性眼內腫瘤，起源于眼中黑色素細胞，是第二常見的黑色素類型。Liu等[31]通過5個UM樣本和5個正常葡萄膜組織樣本進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)circRNA在二者間存在差異表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，一種新型circRNA(circ_0119872)在UM細胞系和組織中顯著上調，circ_0119872的過表達可促進UM細胞惡性化，而沉默circ_0119872則可抑制UM細胞惡性化。在體外實驗驗證circ_0119872促進細胞增殖和加快血管生成，在體內實驗驗證其可促進腫瘤的生長，起到致癌基因的作用。與此同時，circ_0119872具有促進UM細胞轉移的潛能，作為miR622的分子海綿競爭性減弱對下游靶基因G3BP1的抑制作用，激活Wnt/β-catenin和mTOR信號通路發(fā)揮作用。

5.3結膜黑色素瘤結膜黑色素瘤(conjunctival melanoma,CM)是一種罕見的威脅視力和生命的眼部惡性腫瘤，由結膜上皮基底層的非典型黑素細胞引起。Shang等[32]通過RNA技術在CM組織和鄰近的正常組織中鑒定出9300種不同的circRNA，其中circMTUS1在CM組織中上調，并證實其在體內外分別促進CM異種移植瘤的生長和CM細胞增殖。circMTUS1通過與hsa-miR-622和hsa-miR-1208相互作用對某些與腫瘤密切相關的途徑進行調節(jié)，從而可稱之為一個致癌基因。

綜上，circRNA在眼部腫瘤方面的探索正在增加，使致盲率和致死率都相當高的眼部腫瘤在臨床無創(chuàng)診斷和腫瘤的轉移播散等方面有了嶄新的思路。為未來攻克眼部腫瘤這一難題提供有力依據(jù)。

6 circRNA與免疫性眼病

circRNA在免疫性相關疾病的研究[33]越來越引起人們的關注。自身免疫性結膜炎是一類主要的免疫性眼病，主要包括Sj?gren綜合征(SS)、結膜類天皰瘡、Stevens-Johnson綜合征等疾病。Sj?gren綜合征在眼部表現(xiàn)為球結膜血管擴張、瞼裂區(qū)結膜充血、角膜上皮缺損等。Su等[34]通過微陣列分析，評估了原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome,pSS)患者中circRNA的表達，且證明hsa_circRNA_001264、hsa_circRNA_104121和hsa_circRNA_045355可能是pSS的生物標志物。Li等[35]研究證實circ-IQGAP2和circ-ZC3H6作為非侵入性生物標志物在pSS診斷中具有潛在的作用，但在Sj?gren綜合征眼部標本如淚液等的circRNA研究還尚未足夠完善，有待進一步研究。

干眼是最常見的眼病，全球發(fā)病率為5%～34%，較為嚴重的干眼主要發(fā)生在與自身免疫相關的干眼中。水通道蛋白5(AQP5)是一種位于細胞膜上的跨膜蛋白，在角膜上皮和淚腺中高表達，與眼部疾病密切相關。有研究將AQP5的水平視為基礎研究中干眼的指標[36]，認為干眼的發(fā)生伴隨AQP5的下降。Liu等[37]發(fā)現(xiàn)水通道蛋白5敲除(AQP5-/-) 小鼠從出生即伴隨干眼癥狀，對其進行蘇木精伊紅染色確認小鼠淚腺的結構變化。從AQP5敲除小鼠和正常小鼠中獲得淚腺，進行高通量測序，確定腺體中circRNA表達譜。進一步預測并驗證了一個與吞噬體相關的circRNA-miRNA-mRNA調控網(wǎng)絡，表明circRNA可以通過該調控網(wǎng)絡的相互作用參與干眼發(fā)病機制相關的AQP5的表達進而為干眼的發(fā)生和預防提供新的理論基礎。但值得注意的是，AQP5缺乏是否會導致干眼尚未得到證實。

葡萄膜炎(uveitis)是一種眼內炎癥，可能由于感染或自身免疫等因素導致，是發(fā)病率較高的眼免疫性疾病。在以往的研究中葡萄膜炎與相關的circRNA的研究記錄較少，而有較多研究論證了miRNA作為葡萄膜炎的生物學標記物[38]。circRNA可作為miRNA海綿發(fā)揮作用且具有高度穩(wěn)定和保守性的獨特優(yōu)勢，值得研究者在葡萄膜炎相關的circRNA方面進行深入研究，有望提出對葡萄膜炎的發(fā)病機制和預防診治突破性的見解。巨噬細胞廣泛分布于全身血液和組織中，既是重要的非特異性免疫細胞，也是先天免疫的重要組成部分。circRNAs在巨噬細胞的發(fā)育、激活和功能中起著重要的作用。在以往的研究中，巨噬細胞與眼部[39]疾病的研究數(shù)量較多，但與circRNA聯(lián)系起來的研究少之又少，可以分析circRNA與巨噬細胞及眼部疾病之間的關系，以進一步探討相關免疫性眼病的發(fā)病機制。

7 circRNA與其他眼部疾病

7.1近視近視是最常見的眼病，全球約有 19.5 億人(占全球人口的 28.3%)患有近視，已成為全球公共衛(wèi)生負擔，但其發(fā)病機制仍不清晰。脈絡膜血管功能障礙被認為是近視眼中嚴重威脅視力的并發(fā)癥。Li等[40]發(fā)現(xiàn)近視眼患者脈絡膜中circFoxO1的水平顯著上調，脈絡膜ECs的增殖、遷移和血管生成可被circFoxO1的沉默所抑制，并減輕體內和離體的脈絡膜血管功能障礙。研究證明circFoxO1沉默可以減少細胞外基質重塑和眼軸伸長，從而抑制近視發(fā)生的進展，此研究為預防和管理近視提供了一種潛在策略。

7.2翼狀胬肉翼狀胬肉是一種常見的眼表纖維血管病變，結膜過度生長進入角膜會影響病例的視覺功能，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤相似，Liu等[41]通過翼狀胬肉與正常結膜組織相比，發(fā)現(xiàn)多個差異表達的circRNA，其中hsa_circ_0007482和hsa_circ_001730等幾個circRNA被認為參與了翼狀胬肉的發(fā)育。成纖維細胞是翼狀胬肉的重要組成部分，上皮細胞與翼狀胬肉的侵襲性與復發(fā)性相關，Li等[42]發(fā)現(xiàn)circ_0085020(circ-LAPTM4B)可調節(jié)翼狀胬肉成纖維細胞的功能，及上皮細胞的活力、遷移和凋亡，可成為潛在的生物標記物。翼狀胬肉是一種多因素疾病，circRNA有望成為一種新型的眼表疾病標記物，需在未來研究中進一步闡明其相關機制。

7.3甲狀腺相關性眼病甲狀腺相關性眼病(thyroid associated ophthalmopathy, TAO)是由于多因素導致的、涉及上面部和眼部周圍組織的自身免疫性疾病，是成人最常見的眼眶疾病之一。Wu等[43]收集了配對的TAO和對照組患者的眼眶脂肪以及結締組織樣本，以確定circRNA在TAO發(fā)病機制中的作用。研究結果表明，circRNA_14936，circRNA_14940和circRNA_12367可能參與TAO的發(fā)病，推斷circRNA_14940-CCND1-Wnt這一重要的調控軸可能是TAO作用機制的信號通路。目前，circRNA在甲狀腺癌等研究較為成熟，但在TAO方面的研究有限，有待進一步深入探討。

8小結

circRNA作為重要的基因表達調控因子，在ncRNA調控領域正冉冉升起，研究circRNA在許多眼病的生理和病理過程中發(fā)揮的關鍵作用，將有助于人們了解疾病的發(fā)病機制、診斷、預后與轉歸，并對眼部疾病的藥物開發(fā)及臨床治療提供新策略?，F(xiàn)已存在多個有關circRNA的數(shù)據(jù)庫，為我們提供生物信息學，有助于對circRNA的進一步理解與研究，但是我們仍需將這些數(shù)據(jù)庫結合分析，以達到研究的正確性和準確性。目前，眼部疾病中circRNA的研究仍處于起步階段，待挖掘的潛力巨大，隨著RNA技術的穩(wěn)步發(fā)展，未來會有更多的研究闡明其生物學功能和機制，為指導臨床診療提供新的靶標。