DTP3治療彌漫大B細胞淋巴瘤研究進展

田珂凡

510006廣東藥科大學，廣東廣州

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)

DLBCL 是一種常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占NHL 的24%[1]。與其他類型的B 細胞淋巴瘤相比，DLBCL 具有高侵襲性，表現(xiàn)為疾病的快速進展。只有50%的患者通過使用包括利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松等混合藥物的標準治療獲得完全緩解，而另外50%的患者預后普遍較差[2]。DLBCL 可進一步分為活化B 細胞(ABC)樣亞型、生發(fā)中心B 細胞(GCB)樣亞型和基于來源細胞未分類的亞型[3]。已知有許多致癌基因與這些疾病相關，如c-myc、bcl-2、bcl-6、EZH2、MYD88、CREBBP、CD79A和CD79B，以及PAX5[2]。

構成型IκB磷酸化激酶β(IKKβ)/核因子-κB(NF-κB)激活在DLBCL中的作用

NF-κB 通路的抗凋亡作用于1995年首次在肝臟中發(fā)現(xiàn)，RelA 敲除小鼠在胚胎形成過程中表現(xiàn)出大規(guī)模的肝細胞凋亡[4]，所以其在免疫系統(tǒng)中的主要作用，特別是在B 細胞生存和成熟中的必要性也被發(fā)現(xiàn)[5]。活化的NF-κB 復合物由RelA 和p50 組成，是一種轉錄因子，通過抵抗自然凋亡來調節(jié)基因，這些基因是正常細胞存活的關鍵，其激活了許多抵抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)信號引起的細胞凋亡基因表達，包括cIAP、cIAP2、XIAP、TRAF1、TRAF2、c-FLIP 和bcl-2成員[6]。此外，還具有直接和間接抑制JNK通路的作用，通過上調生長抑制和DNA 損傷誘導的Gadd45β蛋白來抑制JNK 通路介導。絲裂酶原活性蛋白激酶7(MKK7)拮抗劑Gadd45β 可以阻止JNK 的磷酸化，從而激活JNK[7]。NF-κB 通路的構成型激活與DLBLC的ABC 樣亞型的生存和惡性腫瘤有關，在ABC 細胞系中觀察到IκBα蛋白體降解、IκB激酶活性與DNA結合具有高發(fā)生率。有研究表明，抑制NF-κB通路可導致ABC-DLBLC細胞系中癌細胞死亡和在G1處生長阻滯[8]。此外，在漿細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤中也觀察到通過上調Gadd45β蛋白表達的特異性JNK抑制[9]。

DLBCL目前的治療方案

淋巴瘤的標準治療方法(R-CHOP 方案)對于新診斷病例的一線治療，可根據(jù)腫瘤大小和分期進行化療。有學者采用利妥昔單抗替代奧布妥珠單抗和添加劑量調整的依托泊苷，同時改變劑量和間隔時間，以改善標準R-CHOP 方案，但治療效果不顯著[10-11]。基于細胞的起源，ABC亞型被發(fā)現(xiàn)在很大程度上是由B細胞受體(BCR)信號通路，然后導致NF-κB通路失調，可能導致失控的細胞增殖和高抵抗細胞凋亡、自噬和壞死[12-13]。基于這一觀察，有學者在標準R-CHOP 方案中添加了一種旨在抑制蛋白體降解的激活RelA 和p50復合物，以特異性靶向BCR和NF-κB通路，然而伊布替尼和硼替佐米在Ⅱ期和Ⅲ期階段均無顯著效果[14]。這表明需要一種新的治療藥物，專門靶向NF-κB通路治療ABC樣亞型，與GCB樣亞型相比，預后較差。

對于復制性和難治性疾病，通?？紤]挽救性化療和自體干細胞移植(ASCT)。然而，使用ASCT 治療的R/R DLCBL 的效果較差，只有37%的患者成功達到了3年無進展生存時間(PFS)，而對于不符合移植條件的患者，則3年PFS甚至更低。

靶向NF-κB通路在癌癥中的益處和局限性

由于NF-κB 在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用，在癌癥中靶向NF-κB 通路可能存在需要解決的顯著缺陷。小鼠中IKKβ 缺失導致的NF-κB 抑制時間延長，由于白細胞介素-1β 水平的升高，導致內毒素休克的發(fā)生率更高[15]。此外，NF-κB通路可以被繞過，尤其是在實體癌癥中，在NF-κB 中觀察到生長抑制，而不是預期的細胞凋亡。此外，還有一些方法可以通過激活該通路的其他成分來覆蓋抑制作用，例如，對IKKβ的抑制作用可以被IKKε 所取代。另一方面，靶向NF-κB 的好處已經(jīng)在一些動物模型中得到了證實。在結直腸癌和肝細胞癌的小鼠模型中也觀察到癌細胞凋亡和癌癥進展停止的結果[13]。在血癌的情況下，多發(fā)性骨髓瘤中NF-κB 抑制顯示了對癌細胞的特異性殺傷，對正常細胞幾乎無不良反應[9]。

Gadd45β靶向藥物在癌癥中的潛力

Gadd45β 基因是NF-κB 復合物的轉錄靶點，編碼的蛋白占據(jù)MKK7 的催化口袋并抑制，MKK7 是負責磷酸化的關鍵激酶，從而激活JNK，最終導致細胞凋亡。這一機制發(fā)現(xiàn)被多發(fā)性骨髓瘤劫持，并開發(fā)了一種高效、低毒性的治療藥物DTP3，可特異性逆轉Gadd45β 對MKK7 的抑制[9]。該藥物證明了Gadd45β在其他類型癌癥中靶向的潛力，許多對NF-κB 途徑上癮的癌癥之一是DLBCL，這可能也存在Gadd45β抑制。此外，Gadd45β復合物也在許多實體癌中被發(fā)現(xiàn)，包括肝細胞癌和結腸直腸癌。

理由和目的

NF-κB 在DLBCL 孤雌生殖中的作用已經(jīng)在許多研究中得到證實，特別是對于更具侵襲性的ABC 亞型。盡管目前使用R-CHOP 方案治療對50%的患者具有顯著治療效果，但另外50%患者需要一種新的高效和安全的治療方法。Gadd45β 是通過NF-κB 復合物抑制JNK 凋亡通路的上調基因產(chǎn)物之一。Gadd45β 合成一種名為DT3的三肽，旨在變構逆轉對MKK7 的抑制，MKK7是激活JNK 的關鍵激酶。DTP3對多發(fā)性骨髓瘤患者細胞表現(xiàn)出良好的治療效果，且對其他組織細胞的毒性較小[9]。這一結果使學者們認為是否可以在DLBCL患者細胞中產(chǎn)生類似的結果，從而更多地闡明其潛在機制和其他類型NHL的開放可能性。

基于上述簡短的推理，進行以下假設：①Gadd45β在ABC-DLBCL 孤雌生殖中具有重要作用：為了研究Gadd45β 在ABC-DLBCL 腫瘤發(fā)生中的作用，制備Gadd45β 野生型和Gadd45β 敲除(KO)小鼠模型。這兩種小鼠模型都具有高的構成性NF-κB 激活來驅動B細胞的增殖和分化。在GC-B 細胞中，通過缺失Blimp1(Blimp1F/F)和cre 介導去除IKK2 上游的STOP序列來實現(xiàn)NF-κB 通路的靶向特異性激活。如果沒有Blimp1，GC-B 細胞將分化為漿母細胞，并在該階段被抑制。通過綠色熒光蛋白(eGFP)可以觀察到腫瘤在各種組織中的存在。采用免疫組化、免疫組熒光和熒光激活細胞分選(FACS)監(jiān)測增殖率、凋亡和致癌細胞通路的激活，如NF-κB、bcl-2、Myc 等。還使用超聲對小鼠進行臨床監(jiān)測，特別是強調腫瘤生長和轉移的存在。②DTP3 可發(fā)展為一種安全有效的治療DLBCL 患者的方法：通過動物模型評估DTP3 的靶效應(療效)程度以及脫靶效應(不良反應)程度。將小鼠注射懸浮于重組基底膜制備的DLBCL 細胞和磷酸鹽緩沖鹽(PBS)，將在免疫抑制NOD/SCID 小鼠中建立異種移植DLBCL 小鼠模型。這些小鼠會出現(xiàn)兩種情況，一為由于FOXN1 突變而缺乏功能性胸腺，二為由于Prkdc突變而導致V(D)J重排受損。根據(jù)腫瘤體積、大小和直徑進行判斷，小鼠將注射不同濃度的DTP3(DTP3 組)或生理鹽水(對照組)。然后在不同時間點處死小鼠，測量腫瘤體積和JNK 激活的細胞凋亡存在。將DTP3 組與對照組進行比較，以研究DTP3 是否停止DLBCL 的進展。如果觀察到陽性結果，將進行TUNEL 檢測凋亡細胞，免疫印跡檢測存在磷酸化的JNK、活化半胱天冬-3(裂解)、滅活半胱天冬-3(未裂解)和PARP-1、半胱天冬-3 的蛋白水解底物。以期望證明DTP3 介導的Gadd45β 抑制導致JNK 激活，最終使腫瘤細胞凋亡。DTP3 在小鼠模型中的安全性研究顯示，對照組和DTP3 組之間的任何行為變化或明顯痛苦跡象進行比較，信號可以來自眼睛、鼻、臉頰、胡須和耳朵等部位，來自其他組織或其他類型的免疫或造血細胞的細胞也將使用具有特定生物標記物的微珠從小鼠中分離。將使用上述相同方法檢測意外的細胞凋亡或JNK 激活，以檢測DTP3 的任何脫靶效應。③DTP3 在DLBCL 細胞系中靶向MKK7：此為確認DTP3與MKK7的相互作用，從而確認DTP3的治療機制。由于DTP3 和MKK7 的相互作用已經(jīng)在多發(fā)性骨髓瘤細胞系中得到證實[9]，目的為觀察是否可以在DLBCL 細胞系中復制。選擇Gadd45β 高表達水平的DLBCL 細胞系，通過RT-PCR 證實這一點。DTP3 和MKK7 的相互作用將通過使用瓊脂糖快速流動樹脂的肽下拉實驗來證實。一旦確認，細胞系將用DT3處理，并使用臺盼藍進行細胞活力試驗，以確認DT3/MKK7相互作用與DLBCL 生長抑制之間的相關性。④DTP3逆轉Gadd45β 對MKK7的抑制并恢復其激酶活性：最后，確認DTP3是否逆轉了Gadd45β對MKK7的抑制作用。進行激酶活性，免疫沉淀的MKK7 和Gadd45β 將在細菌表達的純化JNK和標記ATP的溶液中，首先測量不添加DTP3的MKK7活性，然后在添加DTP3后確認MKK7的激酶活性是否按預期進行逆轉。

結 語

綜上所述，50% 的DCBLC 患者對標準的RCHOP 治療方案反應良好，復發(fā)或難治性病例的預后一般較差。目前R-CHOP 替代方案無顯著效果，且有不良反應。DTP3 在多發(fā)性骨髓瘤中顯示了進一步研究的可能性。如果DLBCL 中的DTP3 產(chǎn)生與多發(fā)性骨髓瘤相似的結果，那么可以相對安全地假設相同的結果可以在劫持Gadd45β/MKK7 復合物的其他類型癌癥中復制。在淋巴瘤、肝細胞癌、垂體促性腺激素腫瘤和結直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了Gadd45β的不調控表達。此外，如上所述，以癌癥類型特異性的方式靶向NF-κB通路一直很困難，如果DTP3抑制DCBLC 的生長，則可以作為DCBLC的選擇性NF-κB抑制劑。這可能說明特定的NF-κB 抑制劑只能通過途徑本身的成分實現(xiàn)，也可以通過特定的下游效應因子，如Gadd45β實現(xiàn)。