葛根芩連湯降低TNF-α 水平改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎機(jī)制研究

李 靜 王思晗 鄒新麗 胡晨旻 虞燕萍 蔣春明

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不明確的慢性、易復(fù)發(fā)的腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）兩種主要臨床類型之一[1]。UC 好發(fā)于結(jié)腸遠(yuǎn)端靠近直腸的部位，病理表現(xiàn)為局限于黏膜及黏膜下層的連續(xù)性淺表性潰瘍[1]。根據(jù)UC 的臨床嚴(yán)重程度，治療上常采用5-氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇、硫嘌呤類藥物和分子靶向藥物等。由于藥物療程長、副作用大、價(jià)格昂貴，且病情容易反復(fù)進(jìn)展，一定程度限制了臨床應(yīng)用[2]。當(dāng)藥物治療無效或者發(fā)生急性重型UC 時(shí)，可采取手術(shù)治療[3]。葛根芩連湯始載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》，以清熱、堅(jiān)陰、止痢為主，兼有透表、解表清里之功，臨床上可治療泄瀉腹痛、感冒發(fā)熱等。本研究采用自由飲用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立小鼠急性UC 模型，研究葛根芩連湯對(duì)其病理損傷和血清炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 體質(zhì)量20～24 g 的C57BL/6 小鼠34只，6～8 周齡，雄性，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。小鼠在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0012。環(huán)境溫度（22±1）℃，保持12∶12 h 光-暗循環(huán)、自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理中心批準(zhǔn)實(shí)施（倫理批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-20201130-10）。

1.2 藥品與試劑 DSS（美國MP Biomedicals 公司，相對(duì)分子質(zhì)量36000～50000，批號(hào)S0798 和Q7418，貨號(hào)160110）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09201121）；葛根芩連丸（廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)2020202）；小鼠IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南通飛宇生物科技有限公司，貨號(hào)MM-0040M2）；小鼠TNF-α ELISA 試劑盒（南通飛宇生物科技有限公司，貨號(hào)MM-0132M2）。

1.3 主要儀器 Thermo 905 系列超低溫冰箱（上海百基生物科技有限公司）；RM2255 全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（Leica Microsystems，Inc）；Beckman Allegra X-15R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物混懸液配制 參考臨床治療劑量，按人-小鼠等效劑量折算[4]，用蒸餾水配制柳氮磺吡啶混懸液260 mg/kg（相當(dāng)于臨床劑量成人2 g/70 kg）和葛根芩連湯混懸液390mg/kg（相當(dāng)于臨床劑量成人3g/70 kg）。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：空白組8 只、模型組10 只、柳氮磺吡啶組8 只和葛根芩連湯組8 只，標(biāo)記后稱重。根據(jù)文獻(xiàn)[2]采用DSS 自由飲用法誘導(dǎo)UC小鼠模型：除空白組外，其余各組小鼠予以2.5%DSS（分子量36000～50000）溶液代替飲用水供其飲用，隔3 d 更換1 次，連續(xù)6 d。在造模第5 天起柳氮磺吡啶組和葛根芩連湯組分別給予相應(yīng)藥物灌胃（給藥容量為10 mL/kg），空白組和模型組灌胃等體積飲用水，每天1 次，持續(xù)6 d。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 小鼠一般情況觀察 造模之日起，每天觀察并記錄食物的攝入量、小鼠體質(zhì)量、糞便情況、精神狀況等。參考文獻(xiàn)進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分[5]：（1）糞便性狀：正常成形便計(jì)0分，不黏附于肛門的糊狀半成形大便計(jì)2 分，可黏附于肛門的稀水樣便計(jì)4 分。（2）便血：肉眼無血便計(jì)0分，肉眼血便計(jì)4 分。（3）體質(zhì)量減輕的百分比：0≤體質(zhì)量下降＜1%計(jì)0 分；1%≤體質(zhì)量下降＜5%計(jì)1分；5%≤體質(zhì)量下降＜10%計(jì)2 分；10%≤體質(zhì)量下降＜15%計(jì)3 分；體質(zhì)量下降≥15%計(jì)4 分。DAI=（糞便性狀+便血+體質(zhì)量減輕的百分比）/3。

2.3.2 小鼠結(jié)腸長度測量、結(jié)腸組織病理學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠，鈍性分離結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸形態(tài)并測量長度。將結(jié)腸組織放入10%的中性甲醛中固定24 h 以上，經(jīng)過梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm），并附于高粘附載玻片上，烘干，次日進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評(píng)估結(jié)腸病理損傷，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分[5]：（1）炎癥反應(yīng)：無計(jì)0 分，輕度計(jì)1 分，中度計(jì)2 分，重度計(jì)3 分。（2）病變累及深度：無計(jì)0分，黏膜下層計(jì)1 分，肌層計(jì)2 分，漿膜層計(jì)3 分。（3）隱窩破壞：無計(jì)0 分，基底1/3 隱窩被破壞計(jì)1 分，基底2/3 隱窩被破壞計(jì)2 分，全部隱窩被破壞，但有完整上皮計(jì)3 分，全部隱窩及完整上皮被破壞計(jì)4 分。（4）病變范圍：＜1%計(jì)0 分，1%～25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，76%～100%計(jì)4 分。

2.3.3 小鼠血清炎癥因子IL-1β 和TNF-α 測定 摘眼球法取小鼠血液，常溫靜置30 min，于3000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存待測。使用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清IL-1β 及TNF-α 的含量，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊用Tamhane's T2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。多組間存活率比較用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同組模型小鼠一般情況 空白組小鼠整體表現(xiàn)正常，體質(zhì)量穩(wěn)步增加，精神狀態(tài)良好。其余各組小鼠在造模后第3 天起出現(xiàn)明顯攝食減少、喜扎堆嗜睡，背毛蓬松粗糙且無光澤，體質(zhì)量顯著下降，并出現(xiàn)大便溏稀、血便。與空白組比較，模型組DAI 評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)葛根芩連湯治療后，葛根芩連湯組小鼠DAI 評(píng)分比治療前明顯下降，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。柳氮磺吡啶組小鼠在第7、10 天各死亡1 只，葛根芩連湯組小鼠在第8 天死亡1 只，各組存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、DAI 評(píng)分及存活率比較（）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、DAI 評(píng)分及存活率比較（）

注：空白組予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃；模型組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液造模基礎(chǔ)上予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺吡啶組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎(chǔ)上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩連湯組自由飲用2.5%DSS 溶液造?；A(chǔ)上予葛根芩連湯（390 mg/kg）灌胃；DAI 為疾病活動(dòng)指數(shù)；“-”為無此項(xiàng)結(jié)果；與空白組比較，aP＜0.05

3.2 不同組模型小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變

3.2.1 不同組模型小鼠結(jié)腸組織大體形態(tài) 空白組小鼠結(jié)腸黏膜表面光滑，無充血，無腫脹，無糜爛與潰瘍；模型組結(jié)腸變短（P＜0.05），腸壁增厚，結(jié)腸黏膜充血水腫，伴有糜爛，腸腔內(nèi)有不成形糞便；柳氮磺吡啶組、葛根芩連湯組小鼠結(jié)腸也可見不同程度的損傷，結(jié)腸長度和腸黏膜充血水腫情況有所改善，腸腔可見成形糞便，結(jié)腸長度與模型組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1 和表2。

圖1 葛根芩連湯對(duì)UC 小鼠結(jié)腸長度影響

3.2.2 不同組模型小鼠結(jié)腸組織鏡下觀察 對(duì)各組小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端組織進(jìn)行HE 染色，結(jié)果顯示，空白組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞完整，腺體排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤和潰瘍形成；模型組上皮細(xì)胞損傷，腺體排列紊亂、破壞甚至消失，隱窩結(jié)構(gòu)改變，炎癥細(xì)胞浸潤形成隱窩膿腫及潰瘍，病變深度嚴(yán)重時(shí)可全累及漿膜層，組織學(xué)評(píng)分與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；柳氮磺吡啶組和葛根芩連湯組炎癥細(xì)胞浸潤深度及數(shù)量減少，上皮完整性、腺體排列改善，但組織學(xué)評(píng)分與模型組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2 和圖2。

表2 各組小鼠結(jié)腸長度和組織學(xué)變化評(píng)分比較（）

表2 各組小鼠結(jié)腸長度和組織學(xué)變化評(píng)分比較（）

注：空白組予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃；模型組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液造模基礎(chǔ)上予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺吡啶組自由飲用2.5%DSS 溶液造?；A(chǔ)上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩連湯組自由飲用2.5%DSS 溶液造?；A(chǔ)上予葛根芩連湯（390 mg/kg）灌胃；與空白組比較，aP＜0.05

圖2 葛根芩連湯對(duì)UC 小鼠組織病理學(xué)變化的影響（HE 染色，×200）

3.3 不同組模型小鼠血清炎癥因子水平比較 與空白組比較，模型組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，葛根芩連湯組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平則明顯下降，其中TNF-α水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與柳氮磺吡啶組比較，葛根芩連湯組小鼠血清TNF-α 下降明顯（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

表3 各組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

注：空白組予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃；模型組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液造?；A(chǔ)上予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺吡啶組自由飲用2.5%DSS 溶液造?；A(chǔ)上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩連湯組自由飲用2.5%DSS 溶液造?；A(chǔ)上予葛根芩連湯（390 mg/kg）灌胃；IL-1β 為白介素-1β；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柳氮磺吡啶組比較，cP＜0.05

4 討論

UC 作為一種復(fù)發(fā)-緩解交替的進(jìn)行性發(fā)展的慢性結(jié)腸炎癥性疾病，可累及肌肉骨骼、眼部和皮膚等多系統(tǒng)多臟器功能損害。目前UC 尚無根治辦法，主要依靠抗炎藥物來誘導(dǎo)緩解和維持治療[3]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥根據(jù)“未病先防、既病防變、瘥后防復(fù)”的治療原則，可在UC 病情發(fā)展不同階段進(jìn)行干預(yù)[6]。葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連和甘草四味中藥配伍而成，作為經(jīng)典古方，主要治療太陽表邪內(nèi)陷所致的熱下利證。葛根芩連湯加減方或聯(lián)合西藥柳氮磺吡啶在臨床上可作為UC 患者的一種治療選擇[7]，但由于中藥復(fù)方組成的復(fù)雜性及作用機(jī)制的不確定性，一定程度限制該方的臨床應(yīng)用。新近研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯具有調(diào)節(jié)腸道菌群、修復(fù)受損腸黏膜以及維持腸道穩(wěn)態(tài)等功能[8-11]。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯可以顯著改善UC 小鼠結(jié)腸充血水腫，修復(fù)腸道組織損傷，促進(jìn)潰瘍愈合，證實(shí)葛根芩連湯對(duì)UC 動(dòng)物模型具有一定療效。

細(xì)胞因子具有調(diào)控腸道炎癥，介導(dǎo)腸道免疫，維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用，在UC 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-α 和IL-1β 是急性UC 早期的重要促炎因子，可以通過招募并活化免疫細(xì)胞如T 細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞（innate lymphoid cells，ILCs）等誘發(fā)腸道免疫反應(yīng)，造成局部炎癥[12]。TNF-α 通過與受體TNFR1和TNFR2 結(jié)合，發(fā)揮多種促炎功能，如使腸上皮細(xì)胞和潘氏細(xì)胞死亡，破壞腸道屏障；招募巨噬細(xì)胞浸潤，從而分泌IL-1、IL-6 等促炎因子，抑制效應(yīng)T 細(xì)胞凋亡發(fā)揮持續(xù)促炎作用等，從而參與UC 的發(fā)生發(fā)展[12]。同時(shí)，由CD14+巨噬細(xì)胞編碼產(chǎn)生IL-1β，可與TNF-α、IL-6 和IL-23 共同誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分化為Th17，進(jìn)而分泌更多TNF-α[1]。本研究結(jié)果顯示，UC動(dòng)物模型的血清TNF-α、IL-1β 表達(dá)水平顯著升高，葛根芩連湯治療可顯著降低UC 動(dòng)物模型血清TNF-α 表達(dá)水平（P＜0.05），而不影響IL-1β 表達(dá)水平，提示作為UC 早期腸道炎癥指標(biāo)的TNF-α 可能是葛根芩連湯發(fā)揮效應(yīng)的分子靶點(diǎn)之一。在治療糖尿病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯可抑制Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和磷脂酰肌醇三羥基激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/雷帕霉素機(jī)械靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路來降低血清TNFα 的水平[9-10]，我們猜測葛根芩連湯在UC 模型中也存在相似通路來抑制TNF-α，需要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。既往文獻(xiàn)報(bào)道，葛根芩連湯在遲發(fā)性腹瀉模型中可顯著降低IL-1β 水平[13]，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛根芩連湯不能顯著降低UC 模型的IL-1β 表達(dá)水平，我們推測可能與研究所用的方劑組成、實(shí)驗(yàn)處置不同有關(guān)。

綜上所述，葛根芩連湯具有改善UC 模型小鼠的臨床表現(xiàn)及結(jié)腸病理學(xué)損害的作用，可能通過抑制TNF-α 的表達(dá)來發(fā)揮藥理作用。葛根芩連湯含有葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸等多種中藥活性成分[14]，它們對(duì)UC 免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制、通路、靶點(diǎn)仍不清楚，因此今后將進(jìn)一步深入研究揭示葛根芩連湯調(diào)節(jié)TNF-α 治療UC 的潛在作用機(jī)制及鑒定可能的有效單體成分，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥臨床治療UC 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。