縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室做好抗體檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)分享

劉青彥，王啟佩

（1.河南省舞鋼市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 舞鋼 462599；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)）

發(fā)展畜牧業(yè)，動(dòng)物疫病防控是關(guān)鍵，而免疫接種已經(jīng)成為目前防控動(dòng)物疫病的首選措施，因而免疫效果監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要，它便于我們準(zhǔn)確了解動(dòng)物疫病的發(fā)生、傳播和流行情況，掌握畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫抗體水平和動(dòng)物疫病保護(hù)情況，還能幫助養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）建立科學(xué)的免疫程序，考核免疫效果，評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量，以及幫助我們科學(xué)、公平、客觀評(píng)價(jià)動(dòng)物防疫質(zhì)量，對(duì)重大動(dòng)物疫情科學(xué)預(yù)警預(yù)報(bào)提供重要依據(jù)，因此，做好免疫抗體檢測(cè)對(duì)畜牧業(yè)健康快速發(fā)展有著十分重要的意義。

縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的抗體檢測(cè)對(duì)象主要包括豬、牛、羊、雞等，豬、牛、羊的抗體檢測(cè)主要通ELISA 試驗(yàn)來(lái)完成，雞的抗體檢測(cè)通過(guò)HA/HI試驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，因HA/HI試驗(yàn)的步驟較為復(fù)雜，影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多，且每份樣品就有四項(xiàng)（即新城疫、禽流感H5N1-11、H5N1-12、H7N9）抗體需要檢測(cè)，筆者從近20 年的檢測(cè)工作中總結(jié)出了一套使試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、高效的措施，該文僅就雞的抗體檢測(cè)（HA/HI試驗(yàn)）加以闡述。

1 做好試驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作

1.1 制備合格的血清

要求待檢血清清亮、無(wú)腐敗、無(wú)溶血，且編號(hào)正確，不重不漏。

1.2 準(zhǔn)備好試驗(yàn)所需的試劑、器材等物品，并擺放到位

準(zhǔn)備好試驗(yàn)所需試劑如：新城疫/禽流感分型標(biāo)準(zhǔn)抗原、PBS 液（筆者所在實(shí)驗(yàn)室常用新開(kāi)啟的生理鹽水代替）、1%紅細(xì)胞懸液等，以及加樣槽、一次性V型塑料反應(yīng)板、適宜量程的移液器及適配滴頭等物品，并將試驗(yàn)所需的滴頭裝進(jìn)滴頭盒備用；且將反應(yīng)板做好標(biāo)記，橫豎各標(biāo)上1.2.3.4…，將這些連同廢棄物桶、消毒藥及試驗(yàn)所需防護(hù)用品如一次性手套、口罩等通通準(zhǔn)備好且擺放到位。

1.3 將待檢血清添加到血清稀釋板

將每份待檢血清（約200 ul）按編號(hào)順序依次添加到血清稀釋板上并在該板邊緣的特定位置及對(duì)應(yīng)的板蓋上做好標(biāo)記，如：一、二、三…（即第一板、第二板、第三板…）。

這一步是使試驗(yàn)快速、高效的最重要的一步，這樣做可以使雞的四項(xiàng)抗體檢測(cè)中的每一項(xiàng)的HI試驗(yàn)中加血清這一步都可以用八道移液器直接從相應(yīng)稀釋板的相應(yīng)列中吸取，一列的八份樣品剛好可以用八道移液器移到相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)板上做一板，這避免了每做一項(xiàng)試驗(yàn)均需從裝樣品的離心管中吸取樣品到反應(yīng)板中這一繁瑣步驟，這使得試驗(yàn)速度大大提高。

2 準(zhǔn)確把握試驗(yàn)過(guò)程的每個(gè)技術(shù)要點(diǎn)

2.1 配制合格的1%紅細(xì)胞懸液

此過(guò)程需要強(qiáng)調(diào)的是：①一定要采集至少三只未經(jīng)免疫的健康公雞的血；②采血過(guò)程一定加抗凝劑防止凝血；③洗滌紅細(xì)胞時(shí)離心機(jī)轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)定在1 000～2 000 轉(zhuǎn)/分鐘較為合適，轉(zhuǎn)速切不可設(shè)置太高，若太高，紅細(xì)胞壓得太實(shí)會(huì)影響其功能甚至導(dǎo)致紅細(xì)胞碎裂；④采集的紅細(xì)胞應(yīng)無(wú)污染，否則可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)而影響試驗(yàn)結(jié)果；⑤洗滌及配制1%紅細(xì)胞一定要用生理鹽水或PBS 液，切不可錯(cuò)用成純凈水或蒸餾水，否則可能因滲透壓差導(dǎo)致紅細(xì)胞崩解破壞；⑥配制1%紅細(xì)胞的PBS 液pH 值需調(diào)至7.2最合適。

2.2 做好HA試驗(yàn)，準(zhǔn)確測(cè)定抗原效價(jià)

HA試驗(yàn)步驟如下：①在96孔V型微量反應(yīng)板中每孔加25 ulPBS；②從第1 孔加25 ul抗原或病毒液，反復(fù)吹吸3到5次混勻；③第1孔吸取25 ul抗原或病毒液，加入第2孔，混勻后，吸取25 ul加入第3孔，進(jìn)行2倍系列稀釋至第11孔，從第11孔吸取25 ul棄去，第12孔為PBS對(duì)照孔；④每孔加入25 ulPBS；⑤每孔加入25 ul1%體積分?jǐn)?shù)雞紅細(xì)胞懸液；⑥結(jié)果判定：輕扣反應(yīng)板混合物，室溫（約20℃），靜置40 min，環(huán)境溫度過(guò)高時(shí)可在4℃條件下靜置60 min，當(dāng)對(duì)照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。判定時(shí)，將反應(yīng)板傾斜60°，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠狀流淌，完全無(wú)淚珠狀流淌（100%凝集）的最高稀釋倍數(shù)判為該抗原的血凝效價(jià)。

HA試驗(yàn)要點(diǎn)為：①加抗原時(shí)一定要先潤(rùn)濕滴頭內(nèi)壁；②抗原倍比稀釋過(guò)程中滴頭以伸入液面下2～3 mm為宜；③移液器加樣時(shí)應(yīng)垂直懸空；④加紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)先搖勻再加；⑤在反應(yīng)板上最好做三排，然后取結(jié)果相同的那兩排效價(jià)定為抗原效價(jià)，此步驟是整個(gè)試驗(yàn)的關(guān)鍵，抗原效價(jià)測(cè)定的準(zhǔn)確性直接影響所測(cè)血樣抗體效價(jià)的準(zhǔn)確性。

2.3 根據(jù)抗原效價(jià)準(zhǔn)確配制4HAU的病毒抗原

根據(jù)HA 試驗(yàn)測(cè)定的效價(jià)配制4HAU 的病毒抗原。4HAU抗原應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果調(diào)整準(zhǔn)確。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1：256，則4HAU=256/4=64（即1：64），取PBS 6.3 ml，加抗原0. 1ml，即通過(guò)1：64獲得4HAU。先計(jì)算該實(shí)驗(yàn)所需4HAU 抗原的量，然后根據(jù)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行配制。為保證所配4HAU抗原的準(zhǔn)確性，通常還要進(jìn)行4HAU抗原校正。

2.4 把握好HI試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn)，準(zhǔn)確測(cè)定血清抗體效價(jià)

HI試驗(yàn)步驟如下：①根據(jù)HA試驗(yàn)測(cè)定的抗原效價(jià)配制4 個(gè)血凝單位（即4HAU）的病毒抗原，4HAU 抗原應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果調(diào)整準(zhǔn)確；②第1孔至第11孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS作為空白對(duì)照；③第1孔加入25 μL血清，第一孔血清與PBS充分混勻后吸取25 μL于第2孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去，第11孔作為抗原對(duì)照；④第1～11 孔均加入25 μL 4HAU 抗原在室溫（約20℃）下靜置30 min或4℃下靜置60 min；⑤每孔加入25 μL 1%體積分?jǐn)?shù)雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，在室溫（約20℃）下靜置40 min或4℃下靜置60 min，空白對(duì)照孔紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果；⑥結(jié)果判定：當(dāng)抗原對(duì)照孔（第11孔）完全凝集且陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)不高于1 ∶4，陽(yáng)性對(duì)照血清抗體效價(jià)與已知效價(jià)差不超過(guò)1個(gè)滴度時(shí)試驗(yàn)方可成立。以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI抗體效價(jià)。

HI 試驗(yàn)過(guò)程需掌握如下要點(diǎn)：①操作熟練、規(guī)范，加樣仔細(xì)、認(rèn)真，不跳孔、不串孔；②使用移液器時(shí)要垂直懸空，傾斜度最好不超過(guò)10°；③加樣劑量準(zhǔn)確，動(dòng)作要求快、準(zhǔn)、穩(wěn)；④樣品倍比稀釋過(guò)程中移液器滴頭必須伸入液面以下（以2～3 mm 為宜），以免產(chǎn)生氣泡；⑤每次加紅細(xì)胞前必須先將其搖勻，加后再輕震反應(yīng)板；⑥每加一種樣品都要更換滴頭。

2.5 其他措施使結(jié)果更準(zhǔn)、使試驗(yàn)更快速、高效2.5.1 劃分“功能區(qū)”

將實(shí)驗(yàn)臺(tái)面劃分成六個(gè)功能區(qū)：加生理鹽水區(qū)、倍比稀釋區(qū)、加4HAU抗原區(qū)、加紅細(xì)胞區(qū)、震蕩區(qū)及結(jié)果判定區(qū)。這有效避免了加樣過(guò)程中的錯(cuò)加、漏加。

2.5.2 固定移液器

“固定移液器”即每個(gè)移液器在相對(duì)固定的時(shí)間段只加某一種樣品，即某個(gè)移液器在相對(duì)固定的時(shí)間段加生理鹽水的只加生理鹽水，加抗原的只加抗原，這不僅有效避免了因忘記更換滴頭導(dǎo)致的錯(cuò)誤，更避免了因頻繁更換滴頭造成的浪費(fèi)，從而大大節(jié)約了滴頭。

3 結(jié)論

通過(guò)以上這些措施，不但實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性得到了充分的保證，還大大節(jié)省了試驗(yàn)所需的時(shí)間，原來(lái)需要3～4 d才做完的試驗(yàn)，現(xiàn)在可以在1 d內(nèi)搞定，這在春秋集中免疫后的集中抗體檢測(cè)時(shí)，因有大量血樣等待檢測(cè)，且每份樣品都有四種抗體需要檢測(cè)時(shí)的效果尤其凸顯。同時(shí)試驗(yàn)材料消耗及廢棄物的處理成本都大大降低。再者，因?yàn)樵囼?yàn)時(shí)間大大縮短，所配4HAU 抗原效價(jià)基本不變，所配紅細(xì)胞還依然保持強(qiáng)勁活力，從而使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。□