腦膠質(zhì)瘤超極化13C-MRI 研究進展

譙金果 吳昊 張偉國*

超極化13C-MRI 是一種通過注射13C 標記的外源性生物探針，在分子層面無創(chuàng)性地探測正常組織和腫瘤組織中13C 的代謝途徑的方法，有別于1HMRS 和FDG-PET 等代謝成像。超極化13C-MRI 能夠?qū)σ酝鶡o法顯示的代謝途徑和生理過程進行快速、非電離、實時分析。近年對超極化13C-MRI 在膠質(zhì)瘤代謝成像方面的應(yīng)用，包括WHO Ⅳ級腫瘤(膠質(zhì)母細胞瘤及其變體)和Ⅲ級腫瘤(星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤和少突星形細胞瘤的間變性變體)的研究日益增多。目前，超極化13C-MRI 在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)反應(yīng)、藥物效力、支鏈氨基酸代謝、氧化還原水平等方面的實驗研究取得了進展，部分常用探針（如[1-13C]-丙酮酸）的超極化13C 成像也進入臨床實驗階段。本文將以膠質(zhì)瘤代謝成像為重點，介紹超極化13C-MRI 最新的實驗和臨床研究進展。

1 超極化13C-MRI 的成像原理

在室溫和臨床MRI 磁場下，體內(nèi)的13C 原子核由于受天然豐度（1.15%）和旋磁比（1H 的1/4）的限制，其MRI 信號強度僅為1H 信號強度的1.6%。欲解決13C 原子信號弱的問題，則需提高原子的豐度和自旋極化能級。Overhauser[1]在1953 年首次提出動態(tài)核極化（dynamic nuclear polarization，DNP）的概念，即在低溫（1~2 K）和中等強度磁場（3.35～6.7 T）環(huán)境下，將高度極化的自由電子自旋轉(zhuǎn)移到原子核自旋，從而短暫提高室溫下原子核的信號強度；2003 年Ardenkjaer-Larsen 等[2]發(fā)明了溶解性動態(tài)核極化（dissolution-DNP，d-DNP），令富集后的固態(tài)超極化13C 探針（13C 豐度＞95%）溶解并轉(zhuǎn)移至生物體內(nèi)，使得MRI 信號增強10 000~100 000 倍，進而獲取探針相關(guān)的代謝反應(yīng)、代謝產(chǎn)物運輸、生物灌注等信息。這種成像方法被稱作超極化13C-MRI。

超極化13C 成像的優(yōu)勢在于其探針的多樣性。由于C 原子參與構(gòu)成所有生物分子的基本骨架，因此任何生物分子都具備成為超極化13C 生物探針的潛力。但超極化13C 探針應(yīng)滿足以下3 個條件：①具有較長的自旋-晶格弛豫時間（T1），便于探針及其代謝產(chǎn)物的觀察和量化；②探針與其代謝產(chǎn)物的化學位移差較大，便于在波譜上區(qū)分；③探針在生理酸堿度下可溶且能夠快速參與代謝，提供足夠的觀測窗口?，F(xiàn)已有多種超極化13C 探針用于膠質(zhì)瘤的能量代謝、藥物效力、氧化還原狀態(tài)等方面的研究，包括[1-13C]-丙酮酸、[2-13C]-丙酮酸、[1-13C]-谷氨酰胺和[1-13C]-抗壞血酸等。

2 血腦屏障對超極化13C-MRI 的影響

超極化13C-MRI 用于膠質(zhì)瘤研究時，血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）可能會限制部分探針的通過，進而降低MR 影像和波譜的質(zhì)量。[1-13C]-丙酮酸、[2-13C]-丙酮酸的濃度以及轉(zhuǎn)化為乳酸（lactic acid，Lac）的表觀速率常數(shù)（kPL）在大腦（0.012 s-1）明顯低于肝臟和腎臟（分別為0.02 s-1、0.028 s-1）[3-4]。不同的麻醉藥物也會導致代謝速率的明顯差異，Marjańska 等[5]研究表明，使用異氟醚或類似的麻醉劑有利于Lac 的檢測，而嗎啡可以最大化增加超極化13C探針的下游產(chǎn)物，可能與BBB 的通透性增加相關(guān)。Miller 等[6]對模型豬大腦進行麻醉發(fā)現(xiàn)，麻醉的深度同樣會影響探針的代謝速率，麻醉劑對探針具有抑制作用，而探針對其具有劑量依賴性；此外，實驗還發(fā)現(xiàn)通過注射甘露醇能夠開放BBB，解除麻醉藥物的抑制作用后，腦內(nèi)的[1-13C]-丙酮酸濃度和kPL得到顯著提升。由于動物實驗常常行淺麻醉，而臨床實驗未采取麻醉措施，這可能是導致動物實驗和臨床實驗結(jié)果出現(xiàn)明顯差異的原因。

盡管BBB 是膠質(zhì)瘤超極化13C-MRI 的限制因素，但對臨床實驗的影響并不嚴重。臨床實驗中，探針的注射劑量遠大于動物實驗，且無麻醉潛在的增益或抑制作用，探針在腦內(nèi)的濃度足以完成超極化13C-MRI 在膠質(zhì)瘤方面的研究。

3 膠質(zhì)瘤超極化13C-MRI 實驗研究

3.1 有氧糖酵解和氧化磷酸化超極化13C-MRI腫瘤細胞傾向于將葡萄糖直接“發(fā)酵”成Lac，這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解[7]。丙酮酸位于糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的交匯點，既可經(jīng)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）催化轉(zhuǎn)化為Lac，也可經(jīng)丙酮酸脫氫酶（pyruvic dehydrogenase，PDH）催化最終轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓釟潲}（HCO3-），這2 種產(chǎn)物可以反映腫瘤細胞有氧糖酵解和氧化磷酸化的水平，所以[1-13C]-丙酮酸是研究腫瘤細胞能量代謝的理想探針，也是目前應(yīng)用最為廣泛的超極化13C 探針。

[1-13C]-丙酮酸探針的主要代謝產(chǎn)物[1-13C]-Lac，在腫瘤有氧糖酵解方面的研究有廣泛應(yīng)用。在Lac 增高的小鼠膠質(zhì)瘤模型中，經(jīng)過糖酵解抑制劑治療的小鼠可觀察到[1-13C]-Lac 減少和kPL降低；在放、化療及聯(lián)合治療、抗血管內(nèi)皮生長因子抗體治療等研究中也可觀察到類似結(jié)果[8-11]。這些研究中的[1-13C]-Lac 減少和kPL降低都先于常規(guī)MRI 檢查中所見到的腫瘤體積變化。由此可見，[1-13C]-丙酮酸探針的使用有利于評估腫瘤的早期治療效果。同時，[1-13C]-丙酮酸探針也可用于分析[1-13C]-Lac 的調(diào)控因素。組蛋白去乙酰化酶抑制劑治療后的膠質(zhì)瘤細胞，單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1/4 的活性增加可導致[1-13C]-Lac 減少[12]；替莫唑胺治療后的膠質(zhì)瘤細胞，由丙酮酸激酶2 活性降低能夠介導[1-13C]-Lac 減少[13]；IDH1 突變型膠質(zhì)瘤的低水平[1-13C]-Lac 則歸因于LDH-A 的缺失[14]。因此，[1-13C]-丙酮酸探針可用于探究藥物作用機制和尋找新的治療靶點。

[1-13C]-丙酮酸探針的另一個代謝產(chǎn)物為[13C]-HCO3-，主要用于研究腫瘤的氧化磷酸化水平。雖然丙酮酸的中間產(chǎn)物乙酰輔酶A 可能進入脂質(zhì)途徑，導致[13C]-HCO3-減少而使結(jié)果存在偏差，但大腦很少進行脂質(zhì)合成，所以[1-13C]-丙酮酸轉(zhuǎn)化為[13C]-HCO3-的表觀速率常數(shù)（kPB）也足以評估細胞的氧化磷酸化水平，這在膠質(zhì)瘤相關(guān)的動物實驗和臨床實驗中得到佐證[14-15]。有研究[16-17]認為，[2-13C]-丙酮酸的代謝產(chǎn)物[5-13C]-谷氨酸（glutamic acid，Glu）可能比[13C]-HCO3-鹽能夠更直接、準確地反映細胞氧化磷酸化水平；因為[1-13C]-Lac/[5-13C]-Glu 反映了丙酮酸在三羧酸循環(huán)的代謝結(jié)果，而[1-13C]-Lac/[13C]-HCO3-更注重反映PDH 和LDH 活性。Salzillo 等[18]使用[1-13C]-丙酮酸觀察膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）在進展期、治療前后、復發(fā)等關(guān)鍵時期的動態(tài)代謝變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有氧糖酵解和氧化磷酸化的顯著異常，證明[1-13C]-丙酮酸探針在區(qū)分腦內(nèi)良惡性腫瘤、區(qū)分GBM 的假性和真性進展以及預測復發(fā)等方面具有指導意義。

3.2 氨基酸及其代謝產(chǎn)物的超極化13C-MRI 研究 氨基酸及其代謝產(chǎn)物包括還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、還原型輔酶Ⅱ、脫氫抗壞血酸和維生素C 等，與腫瘤調(diào)控氧化還原水平有關(guān)，部分代謝產(chǎn)物很難通過傳統(tǒng)影像學檢查直接觀察或量化，但超極化13C-MRI 提供了可能。Batsios 等[19]將γ-谷氨酰-[1-13C]-甘氨酸注射于大鼠膠質(zhì)瘤模型中，荷瘤大鼠的代謝產(chǎn)物[1-13C]-甘氨酸含量明顯高于健康大鼠對照組，該反應(yīng)由γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γglutamyl transferase，GGT）介導，活性升高的GGT 與GSH 水平直接相關(guān)，而GSH 可以反映腫瘤細胞的氧化還原水平。因此，γ-谷氨酰-[1-13C]-甘氨酸探針有助于評估膠質(zhì)瘤的氧化還原水平。

支鏈氨基酸（BCAA）對腫瘤增殖至關(guān)重要，過表達的支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（branched chain amino acid transferase 1，BCAT1）往往意味著惡性腫瘤預后不良[20]。Suh 等[21]在小鼠膠質(zhì)瘤模型中注射[1-13C]-α-酮異己酸（α-ketoisocaproic acid，α-KIC）后發(fā)現(xiàn)，由BCAT1 介導生成的[1-13C]-亮氨酸減少，而由α-酮酸脫氫酶復合物（branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex，BCKDC）介導生成的[13C]-HCO3-增加，這說明膠質(zhì)瘤中的α-KIC 傾向于氧化供能而不是通過轉(zhuǎn)氨基生成亮氨酸。在繼續(xù)注射[U-13C]-亮氨酸后，觀察到亮氨酸凈轉(zhuǎn)化為α-KIC，提示膠質(zhì)瘤中BCAA 可能通過BCAT1/BCKDC的上調(diào)以增強氧化代謝。因此，[1-13C]-α-KIC 探針在氨基酸代謝失調(diào)的領(lǐng)域中具備應(yīng)用潛力。

3.3 IDH 突變膠質(zhì)瘤的超極化13C-MRI 研究 研究[22]表明，70%~90%的Ⅱ/Ⅲ級膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性GBM存在IDH 突變，這種突變導致腫瘤細胞內(nèi)的α-酮戊二酸（α-KG）沒有轉(zhuǎn)化為常規(guī)代謝產(chǎn)物琥珀酰輔酶A，而是轉(zhuǎn)化為一種新的代謝產(chǎn)物2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutaric acid，2-HG），2-HG 被認為是IDH突變型膠質(zhì)瘤的驅(qū)動因素[23]。Salamanca-Cardona 等[24]在體外模型直接觀察到[1-13C]-谷氨酰胺向[1-13C]2-HG 的快速轉(zhuǎn)化，而注射[U-13C]-葡萄糖后，監(jiān)測到體外模型80%以上的[1-13C]2-HG 來自于[1-13C]-谷氨酰胺，證明谷氨酰胺是2-HG 的特定來源。Ruiz-Rodado 等[25]進一步采用[1-13C]-丙酮酸追蹤IDH 膠質(zhì)瘤模型中13C 的代謝，再利用[U-13C]-葡萄糖和[U-13C]-谷氨酰胺驗證，也得到上述結(jié)論。該研究還發(fā)現(xiàn)在腫瘤區(qū)域存在多種氨基酸失調(diào)，且IDH突變膠質(zhì)瘤升高的[1-13C]-Lac 并非來自于[U-13C]-葡萄糖的直接代謝，而是源于[U-13C]-谷氨酰胺的糖異生，揭示了IDH 突變膠質(zhì)瘤主要的代謝改變。

3.4 膠質(zhì)瘤超極化13C-MRI 在其他領(lǐng)域的研究 膠質(zhì)瘤超極化13C-MRI 在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)外pH 的實時監(jiān)測、膠質(zhì)瘤的灌注顯像等方面也取得了一定的進展。細胞內(nèi)外pH 可以影響HCO3-和CO2之間的快速交換，與正常細胞相反，膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的pH 值往往大于細胞外。Lim 等[26]使用[13C]-碳酸銫對腫瘤細胞內(nèi)外pH 行超極化13C-MRI 研究，記錄腫瘤進展過程中多個時間點的細胞內(nèi)/外pH 值，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)外pH 差值隨著腫瘤的體積增大而升高。這是對膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)外酸堿度的首次超極化13C-MRI，將來可能有助于指導膠質(zhì)瘤的治療決策和評估治療效果。

目前，[13C]-尿素在心血管疾病、腎臟疾病和部分腫瘤（如前列腺癌）的超極化13C-MRI 灌注研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[27]，但由于BBB 會限制尿素的通過，腦內(nèi)[13C]-尿素濃度過低，使得膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的超極化13C-MRI 灌注研究較難開展。Park 等[28]開發(fā)了一種新的灌注探針[13C]-羥甲基環(huán)丙烷，比[13C]-尿素的T1時間更長且更容易穿過BBB，研究成功觀察到膠質(zhì)瘤模型的血流灌注增加。隨后，Park 等[29]研究發(fā)現(xiàn)[1-13C]-丙酮酸成像的標準化Lac 鹽、含13C 標志物的信號總和與動態(tài)磁敏感增強MRI 灌注參數(shù)呈強相關(guān)，提示[1-13C]-丙酮酸的成像參數(shù)也可以推斷膠質(zhì)瘤灌注情況，這為膠質(zhì)瘤的超極化13C-MRI 灌注顯像提供了新的研究方向。

4 膠質(zhì)瘤超極化13C-MRI 臨床研究

4.1 首次用于膠質(zhì)瘤病人 2018 年Miloushev 等[30]首次將超極化13C-MRI 應(yīng)用于膠質(zhì)瘤病人，經(jīng)靜脈注射[1-13C]-丙酮酸，11.7 s 后可通過MRS 監(jiān)測到腦內(nèi)相應(yīng)的[1-13C]-丙酮酸信號、下游產(chǎn)物[1-13C]-Lac和[13C]-HCO3-信號。目前，[13C]-HCO3-的信號強度較弱而無法量化，但[1-13C]-Lac 信號強度足夠，可觀測到顯著的[1-13C]-Lac 峰和kPL升高，且在注射后23 s 可以被量化。與常規(guī)MRI、增強MRI 以及FDGPET/CT 相比，超極化13C-MRI 在膠質(zhì)瘤領(lǐng)域同樣可以快速評估腫瘤代謝，為后續(xù)的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

4.2 臨床研究進展 Autry 等[31]對3 名健康志愿者和5 例膠質(zhì)瘤病人行[1-13C]-丙酮酸成像，參照首次臨床實驗，[1-13C]-丙酮酸注射劑量為0.43 mL/kg、注射流率5 mL/s，最后注射20 mL 生理鹽水，以kPL和kPB作為對比指標。結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤病人的正常腦白質(zhì)區(qū)域與健康志愿者的腦白質(zhì)區(qū)域的kPL和kPB相仿，這表明膠質(zhì)瘤病人的正常腦白質(zhì)區(qū)域可能是一個合適的對照區(qū)域，無需設(shè)置額外的健康對照組。病人經(jīng)過貝伐單抗治療后，kPL和kPB整體升高，這可能和BBB 的滲透性改變有關(guān)。在復發(fā)進展的膠質(zhì)瘤中，無論增強MRI 上是否能觀察到異常強化灶，超極化13C-MRI 都能觀察到kPL升高，可見[1-13C]-丙酮酸成像對膠質(zhì)瘤代謝的細微變化更加敏感，對于膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療評估具有重要價值。

Grist 等[32]對4 名健康志愿者進行超極化13C-MRI檢查，嘗試對正常大腦中的丙酮酸代謝進行觀察量化，結(jié)果顯示在BBB 完整的情況下，[1-13C]-丙酮酸成像可以采集到kPL和kPB信息，且與其他臨床研究[29-30]的結(jié)果一致；同時這些研究發(fā)現(xiàn)，在大腦的灰質(zhì)和白質(zhì)之間，丙酮酸代謝存在顯著差異，在灰質(zhì)中更加活躍。正常大腦的超極化13C-MRI 對后續(xù)病理大腦的代謝研究有重要意義，需要更多受試者的參與和數(shù)據(jù)采集的標準化，這意味著更大規(guī)模的臨床實驗和多機構(gòu)合作，也是超極化13C-MRI 發(fā)展中面臨的挑戰(zhàn)。

此外，Autry 等[15]首次將超極化13C-MRI 應(yīng)用于6 例兒童病人，評估了[1-13C]-丙酮酸的2 種注射劑量，即成人耐受劑量（0.43 mL/kg）和較低劑量（0.34 mL/kg），注射流率1~3 mL/s，均未觀察到劑量限制性毒性或不良事件，證明了超極化13C-MRI 的安全性和耐受性。相比于成人，兒童在注射[1-13C]-丙酮酸后能夠更快地將其輸送到大腦，這可能與兒童的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性更高有關(guān)，但這并不意味著兒童大腦的成像效果比成人的更好。相反，兒童的超極化13C-MRI 往往受到更多其他條件影響。此外，對于兒童成像時是否應(yīng)該麻醉目前尚存爭議。首先，麻醉可能會降低BBB 通透性，進而降低大腦的探針濃度；其次，較低的注射劑量會進一步降低探針濃度，最終導致超極化13C-MRI 成像失??；但不麻醉的兒童病人，在檢查期間依從性較差。值得說明的是，此次試驗實際納入的10 名兒童均未麻醉，其中4 名因注射[1-13C]-丙酮酸失敗退出，余6名兒童中有3 名未能接受最大劑量，僅3 名兒童注射了成人耐受劑量。這是未來在兒童群體中應(yīng)用超極化13C-MRI 必須討論的問題。

[2-13C]-丙酮酸的超極化13C-MRI 同樣具備相當?shù)陌踩院湍褪苄?，Chung 等[33]采用與[1-13C]-丙酮酸相同的注射劑量和速度，成功觀察并測定了[2-13C]-丙酮酸、[2-13C]-Lac、[5-13C]-Glu 及代謝產(chǎn)物的濃度，且[2-13C]-丙酮酸的kPL和[1-13C]-丙酮酸的kPL一致。由于[2-13C]-丙酮酸的代謝產(chǎn)物[5-13C]-Glu 對細胞氧化磷酸化水平的評估更加直接、準確，所以其較[1-13C]-丙酮酸成像在相關(guān)疾?。ㄈ缟窠?jīng)退行性病變）中應(yīng)用更具潛力。

5 小結(jié)

在過去10 年中，超極化13C-MRI 的相關(guān)研究已經(jīng)證明該技術(shù)可以作為一項新的腦腫瘤成像方法。超極化13C-MRI 敏感度高，可以實時、快速和無創(chuàng)探測活體組織代謝，能夠?qū)Σ煌[瘤的不同代謝產(chǎn)物進行檢測，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物學研究提供了新的視野。目前，實驗和臨床研究領(lǐng)域針對不同的代謝途徑已開發(fā)多種超極化13C 探針，將進一步推動超極化13C-MRI 的臨床應(yīng)用。