論東北地區(qū)主栽楊樹品種的SSR 分析及鑒定

王成剛

(遼寧省法庫縣自然資源與行政執(zhí)法中心，遼寧 沈陽 104000）

通過對東北地區(qū)林木栽種情況的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)楊樹品種栽種居多，其主要原因來自楊樹具有改善氣候條件、凈化空氣以及降低噪聲污染等功能作用，但在目前楊樹品種鑒別過程中，對其進(jìn)行SSR 分析及鑒定，能為楊樹育種研究高效工作開展提供極大地便利，提升楊樹品種鑒別能力，切實解決因市場中不斷出現(xiàn)多種類楊樹品種而引發(fā)的識種辯種難度大問題，維護(hù)苗木交易市場秩序，從根本上保障品種權(quán)人合法權(quán)益不受損害。本次研究結(jié)果可為遼寧省沈陽市法庫縣地區(qū)楊樹品種保護(hù)及鑒定工作開展提供強(qiáng)有力支撐。

1.栽種楊樹的作用

栽種楊樹的作用具體表現(xiàn)在以下幾個方面：

一是環(huán)境質(zhì)量有效改善。楊樹栽種區(qū)域周邊環(huán)境溫度調(diào)節(jié)、空氣質(zhì)量有著明顯變化，大樹冠且茂密是楊樹外觀基本特點，夏季時節(jié)，其茂密的樹冠可將一部分太陽輻射進(jìn)行吸收，在蒸騰與光合作用影響，使得輻射熱量降低，即時溫度升高也不會產(chǎn)生過熱感受。北方地區(qū)通常選擇楊樹作為主要樹種進(jìn)行栽種，防暑降熱效果十分明顯，有效改善環(huán)境質(zhì)量同時，也能為居民打造更加舒適和涼爽的城市環(huán)境。

二是空氣得到有效凈化。由于空氣中含有大量粉塵、二氧化碳以及其他有害有毒氣體等，栽種高大型楊樹，并將其用于防護(hù)林，可將空氣中多種類型有害有毒氣體進(jìn)行部分吸收，并會有大量氧氣釋放出來，進(jìn)而起到有效凈化空氣的作用，提升大氣環(huán)境質(zhì)量。

三是預(yù)防疾病及減少噪音污染。楊樹栽種區(qū)域，可將周邊環(huán)境空氣中微顆粒數(shù)量變少，細(xì)菌沒有可依附的物體，進(jìn)而使得空氣中原有病菌含量下降，疾病得到有效預(yù)防和控制。加上楊樹自身具備較強(qiáng)抗污染性，合理化栽種楊樹有利于降低城市居民發(fā)生疾病的幾率。另外，楊樹可對周邊產(chǎn)生的噪音進(jìn)行吸收，起到對噪音強(qiáng)度進(jìn)行減弱的作用，加上楊樹樹冠比較茂密，其降低污染影響愈加明顯。

2.栽楊樹品種SSR 分析及鑒定的必要性

在林木育種研究過程中，鑒定林木品種是其中最為重要的一項工作內(nèi)容，形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記，也稱之為同工酶法，是以往較常運(yùn)用的鑒定方式，但在實際運(yùn)用過程中，此鑒定方式具有一定局限性，無法通過同工酶與蛋白質(zhì)電泳技術(shù)只能檢測出數(shù)量相對較少的位點，受多態(tài)性水平限制，針對具有極近親緣關(guān)系的林木品種進(jìn)行鑒定，無法起到精準(zhǔn)鑒別的作用。

站在分類學(xué)角度上分析，楊樹被劃分在楊柳科，在華北、西北、東北等地域較為遼闊地區(qū)廣泛分布，目前楊樹品類較為豐富，含有多個品種，也包含從國外引進(jìn)的品種。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，楊樹作為一種經(jīng)濟(jì)性木材，發(fā)揮著重要作用，所帶來的經(jīng)濟(jì)效益十分可觀，因楊樹特殊性，也是工業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)中較為常用的材料，進(jìn)而具備較強(qiáng)的用途適用性。隨著市場需求不斷變化，楊樹新品種研究持續(xù)深入，雖然經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)要求得到充分滿足，但卻給楊樹品種鑒定工作提升了難度。若選擇傳統(tǒng)鑒定方式，在實際楊樹品種鑒定過程中，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性較低，楊樹品種難以精準(zhǔn)且高效區(qū)分，在一定程度上加劇苗木交易不法行為，帶給品種保護(hù)工作落實極大地阻礙，也會嚴(yán)重?fù)p害品種權(quán)人的合法權(quán)益。

基于此，加大針對行之有效鑒定方式研究非常必要，精準(zhǔn)、快速區(qū)分楊樹品種，如SSR 分子標(biāo)記鑒定法，因具備操作便捷、多等位、高多態(tài)性等特點，在對多樣性遺傳資源、系統(tǒng)發(fā)育等方面進(jìn)行探究時，運(yùn)用SSR 分子標(biāo)記鑒定法，不僅有著明顯運(yùn)用優(yōu)勢，也能進(jìn)一步提升楊樹品種鑒別與良種保護(hù)工作效率和質(zhì)量。

3.東北地區(qū)主栽楊樹品種如何開展SSR 分析及鑒定

本文選擇遼寧省沈陽市法庫縣地區(qū)的楊樹新品種、良種以及主要栽培品種作為試驗研究對象，通過SSR 分析對各楊樹品種的無性系進(jìn)行研究和鑒定。

3.1 試驗楊樹品種選擇

通過選取遼寧省沈陽市法庫縣地區(qū)主要栽種的楊樹品種，選定40 個楊樹品種進(jìn)行試驗，楊樹品種均由當(dāng)?shù)亓謽I(yè)科學(xué)研究機(jī)構(gòu)單位提供。

3.2 試驗方法

楊樹品種DNA 提取與瓊脂糖凝膠電泳檢測：第一，需要確認(rèn)楊樹葉片新鮮程度，對應(yīng)每個楊樹品種進(jìn)行3-4個葉片采集，并在塑封袋中完整存放，再放置實驗室冰箱中，此時冰箱溫度設(shè)置為零下20 度；第二，楊樹基因組DNA 可選用現(xiàn)階段行業(yè)內(nèi)新型基因組DNA 提取試劑盒，有利于提升楊樹基因組DNA 提取效率，樣品規(guī)格為2μL，瓊脂糖凝膠電泳的質(zhì)量濃度設(shè)置為10g/L，將準(zhǔn)備的樣品放置其中并進(jìn)行檢驗，委托地方生物科技單位幫助合成21 對SSR 引物。

瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)量濃度設(shè)置為30g/L，將此時獲得的PCR 產(chǎn)物放置其中并進(jìn)行檢測，確認(rèn)是否有其他產(chǎn)物存在。

PCR 產(chǎn)物的電泳檢測流程：

3.2.1 潔凈玻璃板準(zhǔn)備2 塊，同等長梳子一只，厚度規(guī)格為1mm。

3.2.2 制備非變性聚丙烯酰胺凝膠留用，根據(jù)試驗要求，質(zhì)量濃度設(shè)置為80g/L。

3.2.3 試驗人員先確認(rèn)凝膠是否已經(jīng)處于凝固狀態(tài)，若未凝固，則需要繼續(xù)等待，等待完全凝固后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行提取，規(guī)格為2-3μL 即可，并在規(guī)格為1μL 的上樣緩沖液中加入，待完全混合均勻后在上樣孔中點入，設(shè)置恒定電壓為200v，移動指示劑中的二甲苯青，電泳停止70 分鐘后，在前提配置好的染色液中放置聚丙烯酰胺凝膠(染色液由質(zhì)量濃度為2g/L 的AgNO3、體積分?jǐn)?shù)1%的冰乙酸等物質(zhì)配置而成)，持續(xù)搖動20 分鐘。

3.2.4 確認(rèn)電泳示蹤液完全消失后，將一定量的蒸餾水加入，每次清洗間隔15 秒，共計兩次，間隔15 秒期間，瀝水需要取出，再將現(xiàn)場配置的顯影液加入其中，輕輕搖晃8 秒，待目的條帶出現(xiàn)后，對各樣品進(jìn)行拍照記錄。

3.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理過程中共分為四個階段：

3.3.1 建立矩陣圖。為了保證電泳結(jié)果能夠順利轉(zhuǎn)化為電子譜圖，試驗人員盡可能選擇人工束帶方式進(jìn)行操作，待上一個環(huán)節(jié)完成后，結(jié)合電子圖譜所顯示的信息完成0/1 二位矩陣制作，多態(tài)性位點無條帶標(biāo)記為0，有條帶標(biāo)記為1。同時試驗人員需要將等位基因矩陣圖在表格軟件中進(jìn)行建立。多態(tài)性條帶比率(RPP):RPP=a/b，a=多態(tài)性條帶數(shù)、b=條帶總數(shù)。

3.3.2 基因片段長度?？v坐標(biāo)設(shè)置為DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)物(DL2000)片段長度對數(shù)值；橫坐標(biāo)則是對應(yīng)目的條帶位移距離。用直尺等輔助工具對不同等位基因位移距離進(jìn)行測量，最后各等位基因片段長度數(shù)值獲得，相對準(zhǔn)確性較高一些。

3.4 結(jié)果分析

3.4.1SSR 擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性。對照21 對SSR 引物序列信息，完成40 份樣品基因組DNA 的PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增，經(jīng)過若干程序操作，選用顯示高擴(kuò)增效率、好特異性、良好穩(wěn)定性以及動態(tài)性較為豐富的18 對SSR 引物，制作供試材料的指紋圖譜，分析各樣品遺傳關(guān)系。

40 個楊樹品種基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增利用上述已經(jīng)選定的18 對引物，并通過非變性聚丙烯酰胺凝膠完成電泳分離操作，在此基礎(chǔ)上相對應(yīng)擴(kuò)增條帶直接獲得。通過查閱本次試驗數(shù)據(jù)記錄，其中多態(tài)性條帶獲得總計100 條，每個引物平均擴(kuò)增條帶約為5.6條，表示100%多態(tài)性比率，擴(kuò)增條帶數(shù)量最多為引物PMGC_2030，擴(kuò)增條帶數(shù)量最少為引物PN1297275。

3.4.2 楊樹雜交品種遺傳相似性。格式處理上述統(tǒng)計好的40 個試驗材料0/1 矩陣圖，并借助相關(guān)軟件進(jìn)一步分析楊樹雜交品種遺傳相似性。通過觀察40 個楊樹品種遺傳相似性系數(shù)變化，各項數(shù)據(jù)均將其遺傳相似性較為準(zhǔn)確的反應(yīng)出來，如各品種間遠(yuǎn)近親緣關(guān)系的呈現(xiàn)。

雜交親緣本質(zhì)上為同一種品系，說明遺傳相似性概率較高，如通過小葉楊與黑楊進(jìn)行雜交的子代，其遺傳相似系數(shù)達(dá)到最高值0.88，可以充分說明，利用上述篩選好的18 對引物，再通過SSR 分子標(biāo)記技術(shù)處理，所獲得的對應(yīng)分子指紋圖譜之間相似性極高。當(dāng)分析具有相同遺傳背景的楊樹品種樣品時，利用SSR 指紋圖譜不僅能夠?qū)⑵淇焖賲^(qū)分，其可辨識度也進(jìn)一步提升。

3.4.3 試驗樣品遺傳相似系數(shù)聚類分析。從40 個楊樹品種聚類分析結(jié)果來看，對上述40 個試驗樣品遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析時，發(fā)現(xiàn)將樹種父母系為同一品類的雜交楊樹品種劃分在一起，如將父本為小葉楊、母本為歐洲黑楊的樹種將其匯聚一類，并將達(dá)到0.74 遺傳相似系數(shù)的樹種再進(jìn)行劃分。聚類時，先聚類母本效應(yīng)較強(qiáng)的雜交品種，再根據(jù)父本之間遺傳不同性來構(gòu)成差異性聚集狀況。各項數(shù)據(jù)顯示，屬于同一種雜交品系的父母本，在聚類過程中，可在較大遺傳相似系數(shù)位置劃分一類，兩個相同品種間的遺傳相似系數(shù)也均達(dá)到0.73 數(shù)值水平，可將其聚為一個類別。此外，當(dāng)某一個楊樹品種的母本和另一個楊樹品種的父本為同一個品種，相較于父母本屬于不同的雜交品系的遺傳相似性，前者更高一些。

3.5 試驗結(jié)果

通過分析與總結(jié)上述各項試驗數(shù)據(jù)信息，得知楊樹品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳背景有著極為密切的關(guān)聯(lián)性。一般情況下，越相似的楊樹品種遺傳背景，其遺傳相似系數(shù)數(shù)值更加接近。本次試驗選擇40 個楊樹品種作為樣品，其中以小葉楊或黑楊為父母本或者父本或母本的品種數(shù)量為34 個，屬于小葉楊和黑楊的雜交子代品種數(shù)量為15 個，均體現(xiàn)出了較高的遺傳相似性。在試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，以小葉楊與黑楊進(jìn)行雜交得出的白城小黑楊，其遺傳相似系數(shù)較低，通過深入研究得知，其品種父母本雖然屬于同一品種，但以小葉楊或歐洲黑楊為親本的品種，可能由于種源不同性等同性質(zhì)因素干擾，促使分子水平上遺傳相似系數(shù)表現(xiàn)出的數(shù)值較小。

針對植物分類、林木遺傳育種等方面研究運(yùn)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒別，相對難度較低，但不適合進(jìn)行普及推廣，適用性較低。天然雜交這一現(xiàn)象在楊樹栽種中較為常見，其人工雜交相對更加簡易，若依靠外部形態(tài)對楊樹品種進(jìn)行鑒別，則會受到環(huán)境等因素影響，無法保證鑒別結(jié)果準(zhǔn)確性，因此，通過應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，不僅能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別方式潛在不足，也能為我國楊樹品種深層次鑒定和良種保護(hù)工作高質(zhì)量開展提供強(qiáng)有力技術(shù)支撐。

因此，遼寧省沈陽市法庫縣楊樹栽種過程中，應(yīng)結(jié)合實際情況，靈活利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)開展楊樹品種鑒別工作，一方面為良種保護(hù)工作提供方便，提升楊樹栽種質(zhì)量，改善本地區(qū)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量；另一方面為整個地區(qū)綜合性綠化規(guī)劃方案制定提供參考依據(jù)，選擇符合本地區(qū)地質(zhì)條件、環(huán)境條件特點的優(yōu)質(zhì)楊樹品種，徹底解決遼寧省楊樹死亡率高問題。

通過實地調(diào)研得知，法庫縣楊樹純林面積大，生長期間病蟲害發(fā)生幾率較高，楊扇舟蛾、楊毒蛾、舞毒蛾、天幕毛蟲等均屬于法庫縣楊樹常見蟲害，極大地威脅了楊樹健康生長，其中楊樹爛皮病、楊樹潰瘍病等病害也時常發(fā)生，對法庫縣楊樹病蟲害防治工作帶來極大挑戰(zhàn)。

導(dǎo)致法庫縣楊樹死亡率高得因素還包括以下幾個方面：一是，引種不當(dāng)。從上述40 個楊樹品種分析結(jié)果來看，其中部分楊樹品種并不適合在法庫縣地區(qū)進(jìn)行種植，在實際引種過程中，過于考慮楊樹品種豐產(chǎn)性，并沒有意識到地域跨度過大引種帶來的負(fù)面影響，法庫縣冬季溫度較低，其引進(jìn)的楊樹品種極易發(fā)生凍害問題；二是，選地不當(dāng)，近些年來，法庫縣降雨量不斷提升，低洼處大量積水無法及時排出，促使楊樹被水澇災(zāi)害影響導(dǎo)致死亡；三是后期林木管理工作不到位，法庫縣地區(qū)溫差急劇變化，則促使樹干內(nèi)部水分流動不正常，受反復(fù)凍結(jié)與融化因素干擾下，會造成楊樹表皮開裂，傷口被病菌侵染，病菌侵染面積持續(xù)擴(kuò)散，同時長勢相對較弱的小楊樹也極易被傳染，導(dǎo)致大面積楊樹死亡情況出現(xiàn)，極大地影響了法庫縣林業(yè)健康發(fā)展。由此說明，鑒定法庫縣主栽楊樹品種工作重要性，明確楊樹品種鑒定在保護(hù)良種，引進(jìn)優(yōu)質(zhì)品種等方面產(chǎn)生的積極作用，有利于從根源上規(guī)避上述問題發(fā)生。

楊樹具有生長快、環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)、木材產(chǎn)量高等優(yōu)點，將其作為法庫縣主要栽種林木品種，有利于法庫縣林業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?；诖?，可通過對法庫縣主栽楊樹品種進(jìn)行SSR 分析及鑒定，了解各品種特性，通過對比各楊樹品種特點，篩選出最為優(yōu)質(zhì)的品種作為主要栽種品種，既能增強(qiáng)楊樹抗病性，又能提高楊樹純林病蟲害防治工作水平，加強(qiáng)楊樹種植管理，促進(jìn)楊樹種植經(jīng)濟(jì)效益、社會效益、環(huán)保效益提升，從而為遼寧省沈陽市法庫縣林業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供基礎(chǔ)保障。

4.結(jié)束語

綜上所述，林業(yè)作為促進(jìn)我國經(jīng)濟(jì)增長的重要產(chǎn)業(yè)，楊樹木材交易為我國林業(yè)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造極高的經(jīng)濟(jì)效益，楊樹品種在日益增長社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展需求作用下越來越豐富，但也伴隨著楊樹品種辨種難度加大等問題出現(xiàn)，傳統(tǒng)鑒定方式具有一定局限性，特別是親緣關(guān)系較近樹種鑒定，基于此，應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，發(fā)揮技術(shù)優(yōu)勢，高效率、高質(zhì)量研究楊樹品種遺傳資源多樣性、系統(tǒng)發(fā)育等問題。