骨活素在骨代謝微環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用

陳天寧 霍凱倫 邵進(jìn)

骨組織正常結(jié)構(gòu)和功能的維持可受多種因素影響，而骨代謝失衡是引起骨量異常改變的直接原因[1]。目前，臨床上有多種骨科疾病與局部或全身骨代謝異常相關(guān)，包括骨質(zhì)疏松癥(OP)、骨不連、異位骨化、骨折延遲愈合和進(jìn)行性骨化性肌炎等[2-4]，可嚴(yán)重影響老年患者的生存質(zhì)量，并增加社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

近年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，諸多與骨代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)，它們與多種骨代謝疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，骨活素（OA）作為骨組織中的一種新型成骨因子，主要與骨代謝微環(huán)境中的細(xì)胞分化和基質(zhì)骨化相關(guān)，并可在骨代謝過(guò)程中發(fā)揮復(fù)雜而精密的正向調(diào)控作用[7-9]。

1 OA的特征

OA也被稱(chēng)為非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）、造血生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)激肽-I型、樹(shù)突狀細(xì)胞肝素整合素配體等。OA最早在非轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，且已被證實(shí)能夠抑制胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[10-11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，OA可在骨硬化模型中顯著高表達(dá)，并可正向調(diào)控成骨細(xì)胞[12]。OA的編碼基因是位于7p15位點(diǎn)的GPNMB基因，其中有11個(gè)在種屬進(jìn)化過(guò)程中高度保守的外顯子。作為Ⅰ型糖蛋白，OA相對(duì)分子質(zhì)量為63923 Da，并有分泌型和跨膜型兩種亞型，分別含有572和560個(gè)氨基酸殘基，主要分布于細(xì)胞膜和溶酶體膜處。OA可分為胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和跨膜區(qū)，胞外區(qū)主要有NECl/NEC2分裂位點(diǎn)、多肽C末端酰胺化位點(diǎn)以及N端或O端糖基化位點(diǎn)等12個(gè)糖基化位點(diǎn)；胞內(nèi)區(qū)則主要有分選信號(hào)和內(nèi)化信號(hào)、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）作用模體、糖原合酶激酶(GSK) 3磷酸化識(shí)別位點(diǎn)等[13-15]。

OA可在骨組織、脂肪組織、心臟、腎臟、部分癌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種組織、器官及細(xì)胞中表達(dá)[15-19]。在不同的物種、組織及細(xì)胞類(lèi)型及其不同的發(fā)育階段或疾病進(jìn)程中，OA的表達(dá)均存在一定差異[20-21]。在骨硬化鼠模型中，骨組織中的OA水平可較正常升高3～4倍。人原代成骨細(xì)胞系的OA表達(dá)，雖然在增殖期仍處于較低水平，但隨著細(xì)胞的不斷分化和細(xì)胞外基質(zhì)的逐步成熟會(huì)逐漸升高，且在骨化期呈顯著高表達(dá)[13]。骨折損傷組織中的OA表達(dá)水平在愈合過(guò)程的不同階段也有差異，具體表現(xiàn)為在傷后第3天開(kāi)始表達(dá)，第10天達(dá)到峰值，第21天開(kāi)始下降[21]。

目前認(rèn)為，OA不但可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和遷移、增殖和分化、功能發(fā)揮以及局部損傷組織的再修復(fù)等多種機(jī)體生理過(guò)程，而且可以發(fā)揮調(diào)節(jié)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等作用[22-23]。已有證據(jù)表明，神經(jīng)性炎癥可能與OA表達(dá)相關(guān)。很多研究都發(fā)現(xiàn)，OA能夠下調(diào)白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α和IL-12等炎性因子和上調(diào)IL-10等抗炎因子，從而抑制其他類(lèi)型的炎癥發(fā)展[14,24]。研究表明，OA作為主要的骨代謝正向調(diào)節(jié)因子，不但能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，加快骨基質(zhì)礦化，而且可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化和增殖，從而加快骨折愈合[7-8]。此外，OA不但能夠維持巨噬細(xì)胞M1/M2型之間的平衡，而且能夠促進(jìn)造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等成熟，降低T淋巴細(xì)胞的活化能力[25-26]。OP、骨折延遲愈合和骨不連等臨床常見(jiàn)的骨代謝性疾病在發(fā)展過(guò)程中均會(huì)出現(xiàn)一定程度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部免疫功能失衡，進(jìn)而直接影響局部的免疫因子水平，并對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用[27]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）患者外周血單核細(xì)胞中的OA呈明顯低表達(dá)，而CD14+單核細(xì)胞中的OA能夠負(fù)向調(diào)控Th17細(xì)胞中核因子κB受體激活因子配體（RANKL）等與破骨細(xì)胞分化和功能相關(guān)分子的表達(dá)，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用。

2 OA對(duì)骨組織細(xì)胞的作用及其在骨代謝中的功能

2.1 OA對(duì)成骨細(xì)胞分化和功能的正向調(diào)控

成骨細(xì)胞是骨發(fā)育和形成過(guò)程的關(guān)鍵功能單位，其發(fā)育過(guò)程主要包括增殖、分化、成熟和基質(zhì)礦化等時(shí)期[28]。在骨代謝過(guò)程中，成骨細(xì)胞主要參與骨基質(zhì)的合成和骨化，成熟的成骨細(xì)胞能夠合成、分泌胞外基質(zhì)并形成類(lèi)骨質(zhì)，類(lèi)骨質(zhì)則在成骨細(xì)胞的介導(dǎo)下完成羥磷灰石沉積的礦化過(guò)程[29]。成骨細(xì)胞在調(diào)控成骨過(guò)程中可受多種激素和細(xì)胞因子等影響。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，OA作為一種新型糖蛋白，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)明顯上調(diào)，是成骨細(xì)胞分化后期和基質(zhì)礦化過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因素[7]。骨重塑和骨改建過(guò)程均涉及成骨和血管生成之間的相互偶聯(lián)，OA不但能夠以劑量依賴(lài)的方式誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1磷酸化、成骨細(xì)胞分化以及體外和體內(nèi)毛細(xì)血管形成，而且可以使顱骨缺損模型局部的血管和新骨形成明顯增加[30-31]。當(dāng)小鼠體內(nèi)OA過(guò)表達(dá)時(shí)，骨形成和體外骨祖細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力均明顯增強(qiáng)；而當(dāng)小鼠體內(nèi)發(fā)生OA功能喪失性突變或使用外源性抗OA抗體時(shí)，堿性磷酸酶活性、骨鈣素和鈣沉積等與骨形成和體外成骨細(xì)胞分化相關(guān)的指標(biāo)水平則顯著下降[8,32]。上述結(jié)果均表明，OA作為骨代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程中的正向調(diào)節(jié)因子，能夠在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化及其功能中發(fā)揮重要作用。

在正常人體生理狀態(tài)下，諸多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與骨穩(wěn)態(tài)的維持，其中包括核因子-κB受體激活因子（RANK）/RANKL/骨保護(hù)素（OPG）、Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、骨形成蛋白（BMP）/Smad、MAPK等多條經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[33-34]。但目前OA介導(dǎo)成骨的分子機(jī)制尚不明確。早期研究認(rèn)為，OA是促進(jìn)C2C12成肌干細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵因素，OA過(guò)表達(dá)能夠顯著提升C2C12成肌干細(xì)胞中局部粘著斑激酶（FAK）的磷酸化水平，從而促進(jìn)C2C12成肌干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞[35]。在OA誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）成骨分化的過(guò)程中，miR-26b上調(diào)能夠直接靶向激活GSK3β/β-catenin并激活經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮協(xié)同作用[36-37]。在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，BMP-2能夠誘導(dǎo)Smad1的磷酸化，后者與OA啟動(dòng)子的Smad1反應(yīng)元件相結(jié)合后，能夠促進(jìn)OA轉(zhuǎn)錄，高水平的OA不僅能夠增加成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，同時(shí)還能促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成、基質(zhì)礦化和骨鈣素分泌[38]。另有研究證實(shí)，OA能夠通過(guò)上調(diào)整合素β1并激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）/MAPK通路來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和功能[39]?？偠灾?，OA作為成骨細(xì)胞中的正向調(diào)控因子，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及其功能的發(fā)揮。因此，OA有望作為OP、骨折不愈合等疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

2.2 OA對(duì)破骨細(xì)胞分化及功能的調(diào)節(jié)

骨代謝平衡的維持有賴(lài)于骨形成與吸收過(guò)程的相互偶聯(lián)，以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能均保持穩(wěn)定[40]。破骨細(xì)胞在生理狀態(tài)下主要發(fā)揮骨改建功能，而病理?xiàng)l件下可造成骨質(zhì)大量丟失[33]。眾所周知，OA能夠靶向作用于成骨細(xì)胞，是促進(jìn)骨形成的有效調(diào)節(jié)劑。但有研究認(rèn)為，OA也是一種新型破骨細(xì)胞蛋白，可在成熟破骨細(xì)胞中高表達(dá)，并且可因受到RANKL激活而上調(diào)[30,41]。

破骨細(xì)胞的增殖分化及其功能發(fā)揮均受OA表達(dá)水平影響。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞來(lái)源的OA可以提升破骨細(xì)胞活性及其骨吸收能力，是破骨細(xì)胞功能發(fā)揮的新型激動(dòng)劑。小鼠破骨細(xì)胞OA轉(zhuǎn)基因模型研究也證實(shí)，OA的靶向過(guò)表達(dá)不但能增加破骨細(xì)胞的體積和細(xì)胞核數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞間融合，而且能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、整合素金屬蛋白酶（ADAM）12、降鈣素受體等基因的表達(dá)[41-42]。目前認(rèn)為，破骨細(xì)胞來(lái)源的OA雖然不是破骨細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)劑，但是能夠在一定程度上通過(guò)RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞的融合和活化。也有研究發(fā)現(xiàn)，OA不但具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的能力，同時(shí)能夠在一定程度上增強(qiáng)破骨細(xì)胞的吸收能力，從而增加局部骨質(zhì)流失。OA突變能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞合成和分泌RANKL，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和功能；此外，當(dāng)OA上調(diào)細(xì)胞內(nèi)MAPK磷酸化水平時(shí)，破骨細(xì)胞的分化能力就會(huì)增強(qiáng)，破骨細(xì)胞生成因子的表達(dá)水平也會(huì)提升。OA還可以通過(guò)蛋白激酶B（AKT）-GSK 3β通路和調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（BCL2）和細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)子Bim表達(dá)來(lái)提高破骨細(xì)胞的存活率[43]。整合素已被證實(shí)與破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)相關(guān)[44]。硫酸軟骨素E能夠通過(guò)阻斷OA與硫酸肝素蛋白多糖和整合蛋白αvβ3之間的相互作用，從而使OA在破骨細(xì)胞分化時(shí)發(fā)揮負(fù)向調(diào)控功能[45]。近年的研究結(jié)果顯示，OA能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制破骨祖細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，而CD44+細(xì)胞可參與OA抑制破骨細(xì)胞生成的整個(gè)過(guò)程，表現(xiàn)為敲除破骨細(xì)胞中的 CD44后，OA對(duì)破骨細(xì)胞分化和募集的抑制作用即被解除。此外，由OA特異性抑制的RANKL介導(dǎo)的ERK激活和破骨細(xì)胞分化過(guò)程也由CD44介導(dǎo)。因此，OA能夠通過(guò)CD44受體抑制破骨細(xì)胞中的ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[46]。此外，脛骨延長(zhǎng)小鼠模型研究也發(fā)現(xiàn)，新生骨組織中的OA表達(dá)在整個(gè)成骨過(guò)程中均顯著增加，且OA能夠減少破骨細(xì)胞對(duì)損傷組織的吸收[47]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在PMOP患者外周血或C57BL/6小鼠脾臟的CD14+單核細(xì)胞中，OA過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制RANKL+Th17細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化和功能發(fā)揮。在對(duì)OA介導(dǎo)破骨細(xì)胞功能的研究中，不同的報(bào)道顯示了矛盾的結(jié)果，其可能原因如下：首先，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，由于影響因素單一、作用體系簡(jiǎn)單，OA可能直接介導(dǎo)破骨細(xì)胞表面受體的活性，從而影響破骨細(xì)胞的分化和功能；其次，在體內(nèi)介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化時(shí)，OA可能處于更為復(fù)雜的體系中，通過(guò)成骨細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的影響間接引起破骨細(xì)胞改變。

基于近期的研究數(shù)據(jù)，我們更有理由認(rèn)為，OA可能是通過(guò)RANKL等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控破骨細(xì)胞分化和活性的。因此，我們更應(yīng)該關(guān)注OA在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中的雙重作用，并綜合探究在人體復(fù)雜條件下OA調(diào)節(jié)骨代謝的深層機(jī)制。

2.3 OA對(duì)其他細(xì)胞的影響

在介導(dǎo)骨代謝過(guò)程中，OA除能夠調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞外，還具有調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等的功能。在骨折愈合過(guò)程中，血腫機(jī)化后能夠形成豐富的纖維骨痂，同時(shí)成纖維細(xì)胞也發(fā)揮一定的成骨作用[48]。有研究認(rèn)為，成纖維細(xì)胞不但具有成骨細(xì)胞的表型，而且能為成骨提供鈣化過(guò)程所必需的鈣，同時(shí)能夠分泌鈣化基質(zhì)和膠原纖絲，因此成纖維細(xì)胞的功能可以滿足骨形成所需要的全部要求[49-51]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞的成骨能力可受PDZ-LIM結(jié)構(gòu)域蛋白（PDLIM）5、Toll樣受體（TLR）2、TLR4以及Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等諸多因素的調(diào)節(jié)[52-54]。OA是成纖維細(xì)胞活化過(guò)程中的重要靶點(diǎn)。早期學(xué)者認(rèn)為，OA能夠在骨折部位成纖維細(xì)胞的成骨過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13,16]。有關(guān)牽張成骨的研究發(fā)現(xiàn)，被OA明顯上調(diào)的成纖維細(xì)胞能夠滲入截骨部位，促進(jìn)骨延長(zhǎng)[47]，但其介導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨效應(yīng)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

目前，越來(lái)越多的細(xì)胞因子被證實(shí)可參與骨形成的調(diào)節(jié)過(guò)程。OA能夠誘導(dǎo)并增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力，并可促進(jìn)骨形成過(guò)程。過(guò)表達(dá)OA的C2C12成肌細(xì)胞能夠明顯提高細(xì)胞中FAK的磷酸化水平和骨特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平，并下調(diào)骨骼肌標(biāo)志物成肌細(xì)胞融合蛋白（MF）-20的表達(dá)，從而誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[35]。該效應(yīng)也在BMSC中得到驗(yàn)證，BMSC來(lái)源的GPNMB外泌體，能夠靶向激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)BMSC的增殖和成骨分化，從而減輕卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的PMOP大鼠模型的骨丟失[9]。

3 結(jié)語(yǔ)

骨代謝穩(wěn)態(tài)的維持是多種因子共同參與的過(guò)程，明確骨代謝調(diào)控通路中的高效靶點(diǎn)，將對(duì)OP、異位骨化和骨折不愈合等骨代謝性疾病的診療具有重要意義。早期認(rèn)為，OA在骨代謝中主要作為正向調(diào)控因子，可介導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化和功能，從而發(fā)揮成骨效應(yīng)。而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，OA不但能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞，而且能夠作為一種新型破骨細(xì)胞蛋白，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及其活性。另有研究表明，OA對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也有一定的促成骨作用。在骨代謝過(guò)程中，OA對(duì)不同細(xì)胞的調(diào)節(jié)，可能取決于與其配體及細(xì)胞類(lèi)型。OA在骨代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中的機(jī)制尚需深入研究，以便為骨代謝性疾病的精準(zhǔn)靶向防治提供可能，同時(shí)為高效靶向新藥的研發(fā)提供理論支持。