代謝組學在宮頸癌篩查和早期診斷中的應用

葛彥君，張雨晨，王新燾，諸海燕

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在全球女性惡性腫瘤中居第4 位[1]。目前，宮頸鱗狀上皮內病變（squamous intraepithelial lesion，SIL）和宮頸癌的診斷主要靠“三階梯程序”，即宮頸細胞學檢查/人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測、陰道鏡檢查和宮頸活組織檢查。宮頸細胞學檢查和HPV 檢測是篩查的基本方法，但HPV 檢測特異度低，細胞學檢查敏感度低[2-3]。因此需要兼具高敏感度和特異度的檢測方法來提高宮頸癌早期診斷的效率，近年迅速發(fā)展的代謝組學在這方面具有較大的應用潛力。代謝組學是指利用質譜、核磁共振波譜等技術，分析機體在受到各種生理、病理或環(huán)境刺激下的代謝產(chǎn)物，代謝物的種類和數(shù)量能夠敏感地反映機體的病理生理變化。代謝組學在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌和結直腸癌等多種腫瘤的篩查方面已取得一定的研究成果。在宮頸癌領域，代謝組學在探索高效、快速、無創(chuàng)的篩查和早期診斷手段的研究中也取得了一定成果。

1 代謝組學具有宮頸癌篩查和早期診斷潛力的證據(jù)

1.1 宮頸癌變進程中代謝物的變化已有研究發(fā)現(xiàn)從健康女性到HPV 感染、SIL、宮頸癌，組織和體液樣本的代謝物有明顯的改變。Ilhan 等[4]研究表明，HPV 陽性者、低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高級別鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）和宮頸癌患者的宮頸陰道灌洗液中代謝物種類有所不同，宮頸癌組檢測到多種特有的代謝物，主要是一些脂質，HPV 陽性組、LSIL 組和HSIL 組也有不同的氨基酸和核苷酸代謝的改變。Nam 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與宮頸上皮內瘤變1 級（cervical intraepithelial neoplasia 1，CIN1）患者和健康人相比，CIN2/3 和宮頸癌患者的血漿中多種脂質水平有明顯改變，包括磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）的下降，以及二酰甘油和單不飽和脂肪酸的升高。Yin 等[6]也發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血漿中PC 的下降和溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）的升高。Hasim 等[7]發(fā)現(xiàn)與健康人相比，CIN 患者血漿中多種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、?；撬帷⒗野彼?、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸）水平下降，在宮頸鱗癌患者血漿中下降更顯著，精氨酸和蘇氨酸在CIN 患者血漿中升高而在宮頸鱗癌患者血漿中下降。對尿液標本的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV 感染者的尿液中5-氧代脯氨酸鹽、赤酮酸和N-乙酰天冬氨酸水平升高[8]，宮頸癌患者尿液中4-雄烯-3,17-二酮、1-甲基腺苷和3-甲基尿苷水平升高[9]。

1.2 宮頸癌變過程中細胞代謝的變化代謝重編程是指細胞內總體代謝框架的改變，腫瘤細胞會經(jīng)歷一系列代謝重編程來滿足自身快速增殖的需要，其中葡萄糖代謝、谷氨酰胺代謝和脂質代謝在腫瘤細胞中變化最顯著。2011 年《Cell》發(fā)表的綜述文章將腫瘤細胞的代謝異常改變歸結為腫瘤細胞的十大特征之一[10]。代謝重編程與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相互影響、相互促進[11]，代謝組學與宮頸癌的發(fā)病機制和病理生理機制有著密切聯(lián)系。

1.2.1 糖代謝方面宮頸癌組織中葡萄糖消耗增加，乳酸產(chǎn)生增加[12]，即存在糖代謝重編程，在氧氣充足的條件下依然傾向于通過糖酵解而非氧化磷酸化來獲取能量，這種現(xiàn)象稱為瓦伯格效應（Warburg Effect）[13-14]，通過此效應能夠更加快速地為腫瘤細胞提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），糖酵解中間產(chǎn)物又能滿足快速增殖的腫瘤細胞的物質合成需要[15]；在LSIL 和HSIL 中也觀察到了葡萄糖和乳酸水平的改變以及乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）、己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HKⅡ）和M2 型丙酮酸激酶（M2-pyruvate kinase，PKM2）等糖酵解相關酶的表達增加，即糖酵解增強在宮頸鱗狀上皮內病變階段就已發(fā)生，提示其可能與宮頸癌的發(fā)生有關[15-16]。

1.2.2 氨基酸代謝方面氨基酸代謝重編程可能在宮頸癌前病變發(fā)展以及進展為浸潤性宮頸癌的過程中起重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血漿多種游離氨基酸水平升高[17]，為快速增殖和高代謝的腫瘤細胞提供了合成蛋白質和核苷酸的原料[18]。也有研究觀察到多種氨基酸水平的下降，有一些可能是癌細胞對其消耗增加所致，如組氨酸，另有一些可能是樣本量小、檢測方法不同導致不同研究出現(xiàn)相反的結果[7]。

1.2.3 脂代謝方面血漿二酰甘油從CIN1、CIN2/3到宮頸癌呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，提示其代謝的增強與宮頸癌的發(fā)生和進展有關[5]；CIN2/3 和宮頸癌患者血漿中多不飽和PC 水平降低，可能是由于宮頸癌進展過程中雌激素失調[19]，導致受其調節(jié)的多不飽和PC 合成的關鍵酶——磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT）表達下降[5]。

1.2.4 微環(huán)境代謝方面Ilhan 等[4]揭示了宮頸陰道微環(huán)境的代謝組學與陰道微生物、生殖道炎癥和宮頸癌變的相互聯(lián)系。該研究發(fā)現(xiàn)了幾種氨基酸代謝物（谷胱甘肽合成中間產(chǎn)物2-羥基丁酸、支鏈氨基酸代謝產(chǎn)物α-羥基異戊酸酯、L-異亮氨酸代謝產(chǎn)物2-羥基-3-甲基戊酸）和幾種脂質（鞘磷脂、亞油酸、鵝脫氧膽酰甘氨酸和脫氧肉堿）與生殖道炎癥程度呈正相關，與乳桿菌豐度呈負相關，而這些物質在浸潤性宮頸癌患者的宮頸陰道灌洗液中具有較高的水平，其中甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholate，GCDC）可誘發(fā)炎癥反應和毒性反應，對上皮細胞具有致癌作用。浸潤性宮頸癌和SIL 患者陰道菌群有所變化，乳桿菌豐度下降，取代以與細菌性陰道病相似的非乳桿菌優(yōu)勢菌群，如加德納菌、鏈球菌和普雷沃菌等，引起浸潤性宮頸癌和SIL 患者宮頸陰道灌洗液中多種氨基酸、核苷酸通路代謝物的上升和肽類代謝物的下降。

2 代謝組學在宮頸癌篩查和早期診斷中的應用

2.1 基于血液標本雖然腫瘤生長于某一特定器官，但是代謝物的變化可能受到體內多個器官的影響，因此血液標本（血漿、血清）能更加全面地反映與腫瘤相關的代謝物變化[17]。

2.1.1 基于血漿標本Hasim 等[20]利用核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）對CIN、宮頸鱗癌患者和健康人的血漿進行分析，發(fā)現(xiàn)了涉及糖代謝、氨基酸代謝和脂質代謝等多種代謝途徑的代謝物差異，基于此建立的模型診斷CIN 和宮頸鱗癌的敏感度分別為91.6%和100%，均高于液基薄層細胞學檢查（thinprep cytologic test，TCT，其診斷CIN和宮頸鱗癌的敏感度分別為80.6%和88.9%）。Yang等[21]利用液相色譜-質譜法（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）分析了宮頸癌患者和健康人的血漿代謝物，構建了包含5 種代謝物（膽紅素、LPC 17∶0、N-油酰蘇氨酸、12-羥基十二烷酸、二十四碳六烯酸）的標志物組合，該組合診斷宮頸癌的敏感度為98%，特異度為99%，受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.99，具有較大的診斷潛力。Yin等[6]利用超高效液相色譜-質譜法（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）分析了宮頸癌患者和子宮肌瘤患者的血漿代謝物，建立了基于2 種PC（PC 18∶1/15∶0 和PC 18∶2/20∶5）和2 種LPC（lysoPC 18∶0 和lysoPC 10∶0）的標志物組合，其區(qū)分宮頸癌和子宮肌瘤的敏感度、特異度分別為93.18%和91.30%，AUC 為0.97。Khan 等[17]利用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法（ultraperformance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析了CIN、宮頸癌患者以及健康人的血漿代謝物，建立了基于7 種代謝物（AMP、天冬氨酸、谷氨酸、次黃嘌呤、乳酸、脯氨酸和焦谷氨酸）的標志物組合，其區(qū)分CIN2/3 患者和健康人的AUC 為0.82，區(qū)分宮頸癌患者和健康人的AUC 為0.83。

2.1.2 基于血清樣本Cheng 等[22]利用超高壓液相色譜聯(lián)合四級桿飛行時間質譜法（ultra-high-pressure liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC/Q-TOF-MS）分析了宮頸癌患者、SIL 患者和健康人的血清脂質，構建了由1 種PC（PC 14∶0/18∶2）和2 種含醚鍵的烷酰基磷脂酰乙醇胺（PE 15∶1e/22∶6、PE 16∶1e/18∶2）組成的標志物組合，區(qū)分宮頸癌患者與非宮頸癌患者（包括SIL 患者和健康人）的驗證集（機器學習中用來調整模型和初步評估模型）敏感度、特異度和AUC 分別為92%、91.5%和0.961，區(qū)分早期宮頸癌患者與SIL 患者的驗證集敏感度、特異度和AUC 分別為0.960、0.815和0.956。Liu 等[23]采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS），分析了宮頸鱗癌患者和健康人的血清肽類，建立了區(qū)分宮頸鱗癌患者和健康人的診斷模型，該模型訓練集敏感度和特異度均為100%，驗證集敏感度和特異度分別為80%和100%。

2.2 基于尿液標本尿液標本的獲取方便、無創(chuàng)、易接受，且能反映全身性的變化。Chen 等[24]采用液相色譜串聯(lián)質譜法（liquid chromatography/tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析了宮頸癌患者和健康人的尿液代謝物，建立了9 種代謝物[脯氨酸甜菜堿、吡啶乙酸、尿刊酸（urocanic acid）、1-甲基鳥嘌呤、尿酸、甲基黃嘌呤、色氨酸、茶堿和肉堿C8:1]組成的標志物組合，其診斷宮頸癌的敏感度、特異度和AUC 分別為92.9%、95.6%和0.997。Godoy-Vitorino等[8]采用氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了高危型HPV 感染者、低高危型HPV 混合感染者和HPV 檢測陰性者的尿液代謝物，發(fā)現(xiàn)了區(qū)分高危型HPV 陽性和HPV 陰性的3 種代謝物——5-氧代脯氨酸鹽、赤酮酸、N-乙酰天冬氨酸，其AUC 分別為0.932、0.932 和0.920。

2.3 基于宮頸組織標本血液和尿液反映的是整個機體包括宮頸以外的其他組織器官的代謝情況，而宮頸組織標本能更精確地反映宮頸局部因病變引起的代謝物改變。Abudula 等[12]采用高分辨率魔角旋轉核磁共振氫譜技術（high-resolution magic angle spinning 1H nuclear magnetic resonance，HRMAS 1H NMR）分析了HPV-16 陽性的宮頸鱗癌、CIN2/3 患者和健康人的宮頸組織發(fā)現(xiàn)，與CIN 患者和健康人相比，宮頸鱗癌患者的宮頸組織內低密度脂蛋白、乳酸和丙氨酸的水平升高，葡萄糖、酪氨酸和苯丙氨酸水平下降，表明這些代謝物可能成為宮頸癌篩查標志物。Tokareva 等[25]采用電噴霧離子化鳥槍脂質組學（ESI-MS shotgun lipidomics）技術探索區(qū)分宮頸癌組織和正常組織的方法，結果發(fā)現(xiàn)基于非極性甘油脂類建立的正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型預測潛力最大，AUC 達0.95，有望成為組織學診斷的補充手段。

2.4 基于細胞學標本目前應用于宮頸癌篩查的宮頸細胞學檢查，需要通過閱片根據(jù)細胞形態(tài)特征做出診斷，有一定的主觀性。一些研究針對細胞學標本進行代謝物分析，以期發(fā)現(xiàn)客觀準確的新篩查手段。Porcari 等[26]采用LC-MS 的方法分析HSIL 患者的宮頸細胞學標本，發(fā)現(xiàn)了HSIL 獨特的分子特征，主要涉及2 種神經(jīng)酰胺和1 種鞘氨醇代謝物，基于此建立的診斷模型區(qū)分HSIL 與無宮頸病變者的AUC 達0.98。Paraskevaidi 等[27]采用激光輔助快速蒸發(fā)電離質譜（laser-assisted rapid evaporative ionization mass spectrometry，LA-REIMS）的技術，分析了高危型HPV 陽性和陰性者的宮頸液基細胞學標本的細胞沉淀，發(fā)現(xiàn)此技術區(qū)分高危HPV 陽性與陰性者的敏感度、特異度和AUC 分別為94%、83%和0.916，區(qū)分CIN2+與無宮頸上皮內病變者（正常及高危型HPV 陽性者）的敏感度、特異度和AUC 分別為91%、73%和0.867。Walker 等[28]收集了HPV 陽性的低級別細胞學異?；颊叩膶m頸細胞標本進行DNA提取后的上清液，采用直接進樣質譜（direct injection mass spectrometry，DIMS）的方法進行分析發(fā)現(xiàn)，代謝組學變化可以反映機體對HPV 的清除能力，即可以在現(xiàn)有篩查程序上加上代謝物測定，來預測HPV 感染持續(xù)的風險，從而更準確地對HPV 陽性的低級別細胞學異?；颊哌M行分流。

2.5 基于泌尿生殖區(qū)混合物對泌尿生殖區(qū)混合物的研究主要是針對其中的揮發(fā)性有機物。該標本的獲取使用女性常用的衛(wèi)生巾即可，操作簡便、易于接受。Guerrero-Flores 等[29]讓經(jīng)過訓練的比格犬通過嗅衛(wèi)生巾獲取的泌尿生殖區(qū)混合物的氣味，來辨別是否為宮頸癌，結果表明受訓犬能夠通過宮頸癌患者的標本中特有的揮發(fā)性有機物區(qū)分出宮頸癌患者和健康人，敏感度和特異度高達96.36%和99.55%。Rodríguez-Esquivel 等[30]采用頂空氣相色譜-質譜法（headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS GC/MS），分析了宮頸癌患者和健康人用衛(wèi)生巾獲取的泌尿生殖區(qū)混合物標本，發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者和健康人的泌尿生殖區(qū)標本中各有數(shù)種特有的揮發(fā)性有機物，并能以此區(qū)分宮頸癌患者和健康人，敏感度和特異度達93%，AUC 達0.89，有望發(fā)展成一種無創(chuàng)、易操作的宮頸癌篩查方法。

3 結語與展望

目前代謝組學在宮頸癌篩查和早期診斷的研究已取得一定成果，代謝物變化與癌前病變和浸潤性宮頸癌的發(fā)生、進展關系密切，對差異代謝物相關通路的分析為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制提供了新途徑，基于差異代謝物建立的診斷模型表現(xiàn)出了較高的敏感度和特異度，顯示出較好的臨床應用前景。但是目前多數(shù)研究樣本量較小，或未控制可能影響代謝物水平的其他因素如年齡、飲食和體質量指數(shù)（body mass index，BMI）等。研究的代謝物范圍較廣，不同研究之間出現(xiàn)一些矛盾結果，尚未有公認的特異性代謝物。多數(shù)研究僅觀察到代謝物變化的客觀事實，而缺乏基礎實驗研究，發(fā)生變化的機制未完全探明。

未來需要樣本量更大、更有針對性的代謝組學研究進一步驗證目前已發(fā)現(xiàn)的有診斷潛力的差異代謝物，并持續(xù)監(jiān)測代謝物在宮頸癌發(fā)生發(fā)展各個階段的動態(tài)變化。若將代謝組學與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學相結合，則有望多層次、全方位地探索代謝物變化的機制，尋找與宮頸癌發(fā)生發(fā)展最相關的標志物，也為宮頸癌的治療提供新思路和新靶點。同時期望理化分析技術和有機化學等相關領域的快速發(fā)展，從而能夠檢測出目前無法檢測的微量代謝物和一些目前結構未知而可能意義重大的代謝物。