類器官技術(shù)在卵巢癌藥敏檢測中的應用

汪婭妮，姜琦，張雨晨，諸海燕

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，國際癌癥研究所（International Agency for Research on Cancer，IARC）統(tǒng)計顯示，2020 年全球卵巢癌新增病例313 959 例，死亡207 252 例[1]。卵巢癌有多種病理類型，最常見的是上皮性卵巢癌，約占90%以上，性索間質(zhì)腫瘤占5%～6%，生殖細胞腫瘤占2%～3%。卵巢癌的初始治療為全面分期手術(shù)或腫瘤細胞減滅術(shù)，術(shù)后輔助紫杉醇聯(lián)合鉑類的化療，而標準的初始治療后約70%的患者會復發(fā)[2]。復發(fā)性卵巢癌主要采用化療、靶向藥物等治療。近些年，新的靶向藥物在卵巢癌中的應用使卵巢癌治療模式發(fā)生了改變，但由于卵巢癌的異質(zhì)性和多態(tài)性，這些藥物的總有效率約為20%[3]，同時醫(yī)師基于臨床指南和以往經(jīng)驗選擇的藥物無法做到個體化的精準治療。因此，構(gòu)建一個精準預測卵巢癌治療效果的臨床前模型，指導卵巢癌的個體化治療，一直是卵巢癌的研究重點。

現(xiàn)有的臨床前模型包括細胞系、動物模型以及患者來源的腫瘤異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型和類器官（patient-derived organoid）等。類器官是一種新型體外3D 培養(yǎng)技術(shù)，其以干細胞或器官祖細胞為原料，在添加多種生長因子、抑制因子和激素的基質(zhì)膠中進行培養(yǎng)，自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)的細胞群。由于其能很好地維持腫瘤細胞的異質(zhì)性，因此基于類器官的藥物篩選結(jié)果與臨床實際治療效果有較高的符合度；同時類器官培養(yǎng)技術(shù)具有方便、快捷、易于制備和成功率高等優(yōu)點，使得其在腫瘤藥物研究方面有著巨大的潛能。近年的類器官熱度起源于荷蘭的Hans Clevers 教授，2009 年Clevers 團隊首次在培養(yǎng)基中添加表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt 信號激動劑、R-脊椎蛋白1（roof plate-specific spondin 1）和骨形成蛋白信號抑制劑頭蛋白（Noggin）等，在體外成功培養(yǎng)出小腸類器官[4]。2011 年，該團隊又引入煙酰胺、p38 抑制劑和Alk 抑制劑A83-01，成功培養(yǎng)出結(jié)腸的多種疾病類器官模型[5]，此后，肝癌[6]、乳腺癌[7]等惡性腫瘤類器官均成功培養(yǎng)并初步應用于臨床。研究表明這些類器官的組織病理學特征、基因突變類型和藥敏測試結(jié)果與在體腫瘤高度一致，是目前腫瘤研究最有效的手段，但同時類器官因具有器官限制性及缺乏免疫細胞等缺點而暫時無法得到廣泛應用?，F(xiàn)介紹卵巢癌類器官的起源發(fā)展及其在卵巢癌藥物治療中的研究進展。

1 卵巢癌類器官的建立

2018 年，Hill 等[8]首次將22 個卵巢癌患者的實體瘤與胸腔穿刺液作為祖細胞，制成腫瘤細胞顆粒，用緩沖液進行洗滌，將其與Matrigel 基質(zhì)膠混合成細胞懸液，再向其中加入含有青霉素、EGF、成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）和煙酰胺等的普通培養(yǎng)基液，最終培養(yǎng)出33 個高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）類器官模型，培養(yǎng)成功率接近100%。HE 染色和免疫組織化學分析顯示，類器官保留了原腫瘤的核多形性、致密染色質(zhì)等所有特征。經(jīng)過全外顯子組測序，Hill 等[8]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7～10 d 的類器官中的基因突變有98.8%也存在于母體腫瘤中，初步證明培養(yǎng)7～10 d 的類器官可以作為患者臨床反應的預測工具。2019 年，Kopper 等[9]成功培養(yǎng)了來自32 例卵巢癌患者的56 個類器官，建立了首個卵巢癌活體生物庫，其中包含了漿液性交界性腫瘤、HGSOC、低級別漿液性癌和透明細胞癌等上皮性卵巢癌的所有亞型，且保留了原發(fā)腫瘤的基因特征，使卵巢癌類器官研究取得重大突破。同年，Phan 等[10]首次嘗試將類器官用于高通量藥物篩選。后來Hart 等[11]成功利用卵巢癌類器官模型模擬卵巢癌的早期腹膜轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)腹膜中的間皮細胞與卵巢癌細胞直接接觸有利于癌細胞的黏附與轉(zhuǎn)移。2020 年，Maenhoudt 等[12]分別利用新鮮的腫瘤組織和冷凍保存的活檢組織在添加了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin-1，NRG1）的培養(yǎng)基中成功培養(yǎng)出卵巢癌類器官，2 種組織培養(yǎng)的成功率都是44%，從而提出了在類器官建立之前儲存臨床樣本的可能性。

2 類器官在卵巢癌藥物篩選中的應用

自Hill 等[8]2018 年成功構(gòu)建了卵巢癌類器官之后，類器官培養(yǎng)技術(shù)在卵巢癌發(fā)病機制與藥物研究方面得到廣泛應用。Maenhoudt 等[12]利用類器官模型發(fā)現(xiàn)，氧化應激和腫瘤蛋白p53（tumorproteinp53，TP53）、磷脂酰肌醇3 激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）等基因參與了卵巢癌的發(fā)生。Jabs 等[13]通過建立同源重組缺陷評分模型對類器官和細胞系培養(yǎng)進行高通量藥物篩選，結(jié)果顯示卵巢癌類器官模型對卡鉑和地西他濱的反應性更加多元化。最近的氣液界面（air-liquid interface）培養(yǎng)成功建立了腫瘤免疫微環(huán)境[14]，氣液界面培養(yǎng)與微流體技術(shù)（microfluidic technology）使類器官在免疫治療領(lǐng)域的應用成為可能。

目前，類器官技術(shù)在惡性腫瘤藥物研究中主要應用于以下4 個方面：①探索腫瘤的耐藥性；②研究藥物的聯(lián)合作用以尋找最優(yōu)的藥物組合方案；③找到藥物對腫瘤的特定靶點，為新藥研發(fā)提供依據(jù)；④進行高通量藥物篩選，達到個體化治療的目的。目前，類器官技術(shù)已被應用于多種惡性腫瘤的藥物篩選，如利用人腎癌類器官進行順鉑療效的評估[15]、利用結(jié)腸癌類器官評估伊立替康在患者體內(nèi)的分布情況[16]。但是，類器官技術(shù)在卵巢癌診斷和治療中應用的研究尚不多見。2020 年，Maenhoudt 等[12]分別利用新鮮的腫瘤組織和冷凍保存的活檢組織成功培養(yǎng)出卵巢癌類器官，隨后，該團隊根據(jù)類器官是否經(jīng)過冷凍保存、卵巢癌病理類型以及是否接受過化療將其分類，并對分類后的類器官進行常用化療藥物的敏感性檢測，研究發(fā)現(xiàn)野生型TP53 卵巢癌類器官對Nutlin-3 的敏感性高于突變型TP53 卵巢癌類器官。同年，Nanki 等[17]利用含有Wnt-3A 和R-脊椎蛋白等的雞尾酒培養(yǎng)基建立了7 對卵巢癌類器官，其中3 對來自漿液性癌，3 對來自子宮內(nèi)膜樣癌，1 對來自透明細胞癌，類器官培養(yǎng)的總成功率為80%（28/35）。Nanki 等[17]用順鉑、卡鉑、紫杉醇、多西他賽、去甲長春堿和托泊替康等23 種美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的藥物，對這7 對卵巢癌類器官進行藥敏試驗，根據(jù)藥物的劑量-反應曲線判定結(jié)果，結(jié)果顯示含有乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）突變的類器官對多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP－ribose）polymerase，PARP]抑制劑、奧拉帕尼和鉑類藥物更敏感，而來自透明細胞癌的類器官則對鉑類藥物、紫杉醇和奧拉帕尼顯示抵抗性。2018 年，Hill 等[8]發(fā)現(xiàn)大約有50%的HGSOC 患者存在DNA損傷修復缺陷，類器官中DNA 損傷修復缺陷都與PARP 抑制劑的敏感性相關(guān)，因此PARP 抑制劑可能是這些患者的潛在治療藥物。由于類器官模型具有培養(yǎng)快速、方便的特點，目前已有學者將其用于高通量藥物篩選，以提高藥物篩選的效率。2019 年，Phan等[10]首次嘗試利用卵巢癌患者來源類器官進行高通量藥物篩選，結(jié)果提示基于類器官技術(shù)的高通量藥物篩選在卵巢癌的治療中有一定的應用價值。近年來的研究都顯示使用類器官進行藥敏試驗可以篩選出具有治療潛力的藥物，能夠為新藥的應用奠定基礎(chǔ)，也有助于為患者提供個性化的治療方案。

3 類器官在腫瘤藥敏檢測應用中的優(yōu)點

卵巢癌藥敏檢測對傳統(tǒng)化療藥物或新型靶向藥物的有效性篩選具有重要作用。細胞系是卵巢癌最常用的臨床前模型，因其技術(shù)簡單、成本低且成功率高，已廣泛用于高通量藥物的篩選；但在長期培養(yǎng)過程中無法維持其腫瘤異質(zhì)性，最終細胞系的藥敏結(jié)果與臨床實際療效呈現(xiàn)較大差異[18]。目前常用的體內(nèi)動物模型包括細胞系異體移植模型和PDX。細胞系異體移植模型是將腫瘤細胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，相比于細胞系培養(yǎng)能更好地模擬腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，并且其藥物篩選實驗結(jié)果與臨床試驗結(jié)果較為一致，但動物模型存在一定的倫理爭議，昂貴且耗時長，這限制了動物模型的運用。PDX 是將患者新鮮的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使腫瘤組織在小鼠體內(nèi)生長而構(gòu)建成的腫瘤模型，此類模型保持了與患者相似的遺傳特性和腫瘤異質(zhì)性[19]，但其受限于建模率低（20%～50%）、周期長（4～8個月）和成本高等問題，不適合高通量藥物篩選。而類器官具有維持腫瘤異質(zhì)性和模擬腫瘤微環(huán)境的優(yōu)點，使其在腫瘤藥敏檢測中有較大應用優(yōu)勢和潛力。

類器官可以維持腫瘤的異質(zhì)性。類器官是以干細胞或器官祖細胞為原料，添加細胞外基質(zhì)替代物Matrigel 膠作為立體支架，最終培養(yǎng)形成的三維細胞團，具有和原位組織相似的結(jié)構(gòu)和功能特性[20]。相較于傳統(tǒng)的腫瘤細胞和動物模型，類器官不僅較好地保留了腫瘤原有的組織學形態(tài)、遺傳信息和腫瘤異質(zhì)性，還具有傳代穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短和取材靈活等特點。腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的重要特征，也是造成腫瘤藥物治療失敗的主要原因。卵巢癌具有較高的異質(zhì)性：上皮性卵巢癌主要包含漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細胞癌和黏液癌這幾種亞型，其致癌基因、預后等均存在較大差異。類器官可以培育出各種類型的卵巢癌，同時相較于其他培養(yǎng)體系，類器官能夠維持卵巢癌的異質(zhì)性[21]。Kopper 等[9]對原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶的類器官進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)類器官與原癌組織的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）數(shù)據(jù)與癌細胞比例相同。Nanki 等[17]用23 種FDA 批準的藥物對7 對卵巢癌類器官進行藥敏試驗顯示，約59.5%的原腫瘤與相應類器官的試驗結(jié)果相同。

類器官可以較好模擬腫瘤微環(huán)境。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)主要由來自于特定組織的祖細胞和人工基底膜或其他適宜的細胞外基質(zhì)組成。細胞外基質(zhì)是信號在不同細胞間傳輸?shù)闹虚g媒介，通過合成、降解、排列和交聯(lián)來改變組成和結(jié)構(gòu)，細胞外基質(zhì)的改變反過來作用于細胞基質(zhì)黏附受體的信號傳導，最終影響組織極性、結(jié)構(gòu)、血管生成和癌細胞侵襲等[22]。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞外基質(zhì)是一種富含多糖修飾的帶電蛋白網(wǎng)絡(luò)，能與多種生長因子結(jié)合。同時細胞外基質(zhì)還包含大量的糖蛋白、蛋白多糖和多聚糖等具有不同生化和物理特性的成分[23]。細胞系培養(yǎng)僅僅將祖細胞在含有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)并沒有腫瘤生長所必需的生長因子，缺少基質(zhì)細胞、細胞間的信息傳遞以及細胞外基質(zhì)[24]。體內(nèi)動物模型維持了染色體的結(jié)構(gòu)，相比于細胞系能更好地維持腫瘤的異質(zhì)性。但是由于體內(nèi)動物模型是將祖細胞注射入免疫缺陷小鼠的體內(nèi)，因此腫瘤微環(huán)境的免疫作用并不能得到充分體現(xiàn)[25]，這導致一些免疫藥物實驗沒辦法在動物模型體內(nèi)進行，因此也存在一定的局限性。而類器官細胞外基質(zhì)很好地模擬了腫瘤的微環(huán)境，為腫瘤的發(fā)生提供了生長所必需的條件。

4 類器官在腫瘤藥敏檢測應用中的缺點

迄今為止，類器官培養(yǎng)技術(shù)尚未完全成熟，腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)存在以下缺點：①正常上皮細胞的過度生長；②缺乏免疫細胞、血管細胞和基質(zhì)細胞，無法模擬腫瘤免疫環(huán)境及血管形成等；③器官限制性，無法培養(yǎng)所有的腫瘤及所有的非腫瘤成分等。

為解決類器官缺乏免疫細胞、基質(zhì)細胞的問題，3D 共培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)逐漸進入人們的視野，有學者將類器官與免疫細胞進行共培養(yǎng)，模擬腫瘤發(fā)展過程中免疫細胞的作用并獲得了成功[26]。改良之后的類器官還可進行免疫治療的臨床前試驗，已經(jīng)有學者成功地將類器官與免疫細胞共同培養(yǎng)來預測免疫治療的效果[26]，但目前還無法將卵巢癌類器官與免疫細胞進行共同培養(yǎng)。3D 共培養(yǎng)技術(shù)也成功解決了基質(zhì)細胞與類器官之間缺乏相互作用的問題[27]。有學者利用大網(wǎng)膜的原代間皮細胞和成纖維細胞的早期傳代在體外重建了卵巢癌的腫瘤微環(huán)境，雖然該系統(tǒng)比較復雜，但若將其與卵巢癌類器官結(jié)合可能會成為藥物篩選的下一代模型[28]。微流體技術(shù)是利用微小通道模仿人體血管，研究血管因素在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的作用[29]，隨著微流體技術(shù)的發(fā)展，3D培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能更好地與微流體技術(shù)相結(jié)合[30]。相信在不久的將來，類器官的這些局限性將會被新的技術(shù)一一攻克。

5 結(jié)語

類器官培養(yǎng)技術(shù)作為一種新型的細胞培養(yǎng)方式，由于其腫瘤復制程度高、較好地保留腫瘤異質(zhì)性、生長周期短及可穩(wěn)定傳代等優(yōu)勢，彌補了細胞系和動物模型等臨床前模型的缺陷，在腫瘤藥物篩選和個性化治療方面具有巨大的潛能。卵巢癌類器官的成功培養(yǎng)和制備使其在卵巢癌方面的應用也逐漸進入人們的視野。一方面，卵巢癌類器官可以模擬卵巢癌的發(fā)展進程，通過對卵巢癌的癌前狀態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)卵巢癌生長過程中的基因突變位點，為疾病診斷和新藥研發(fā)提供依據(jù)，實現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療；另一方面，目前類器官已經(jīng)應用于卵巢癌的藥敏試驗，結(jié)合高通量藥物篩選，為將來患者的個性化治療提供臨床前試驗依據(jù)。另外，通過對患者來源的類器官進行培養(yǎng)，可以評估患者預后，為及時調(diào)整治療方案做出前瞻性判斷。但是類器官和功能齊全的器官還有較大的差距，而且類器官技術(shù)也存在局限性，其不能完全模擬腫瘤免疫環(huán)境并且具有一定的器官限制性。目前，高速發(fā)展的共培養(yǎng)技術(shù)、微流體技術(shù)已經(jīng)在逐步克服類器官的缺陷，相信在不久的將來，類器官技術(shù)將會更加完善，從而實現(xiàn)卵巢癌的個性化治療。