類器官在腫瘤研究中的應(yīng)用

黃華，姚書忠

體外培養(yǎng)2D 細(xì)胞（如細(xì)胞系、原代細(xì)胞）因其簡單易獲取、操作成熟及可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)行腫瘤研究中最常用的腫瘤模型。但隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的遺傳異質(zhì)性、腫瘤與腫瘤微環(huán)境間的相互作用等腫瘤特性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、抗藥耐藥等腫瘤生物學(xué)行為息息相關(guān)[1-2]。而腫瘤細(xì)胞系在體外培養(yǎng)時(shí)脫離了原有的復(fù)雜體內(nèi)生存環(huán)境，經(jīng)過體外單一環(huán)境的長期選擇性培養(yǎng)、細(xì)胞系內(nèi)適應(yīng)性克隆擴(kuò)增和非適應(yīng)性克隆丟失，使其失去了原腫瘤的遺傳異質(zhì)性。腫瘤細(xì)胞系內(nèi)細(xì)胞組成單一，僅由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，不包含間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，無法模擬腫瘤微環(huán)境；而另一種常用的人類腫瘤研究模型——患者來源的腫瘤異種移植（patient-drived xenograft，PDX）模型直接來源于患者，能準(zhǔn)確反映腫瘤的遺傳異質(zhì)性，也可聯(lián)合基質(zhì)一同植入，模擬腫瘤微環(huán)境，但PDX 模型成本高、耗時(shí)長等缺點(diǎn)限制了其在腫瘤精準(zhǔn)治療中的廣泛應(yīng)用。近年來發(fā)展迅速的3D 腫瘤模型與PDX 模型相同，直接來源于患者，能夠保留腫瘤特性，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，使離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞處于一個(gè)更接近于真實(shí)環(huán)境的狀態(tài)，與常用的2D 細(xì)胞相比，其能更好地反映原腫瘤的細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)，保留細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，并提高了高通量平臺在腫瘤藥物篩選研究中的應(yīng)用[3-4]。常見的體外培養(yǎng)3D 腫瘤模型按培養(yǎng)方式分為以下3 類：①懸浮球狀腫瘤模型（floating spherical cancer models），低吸附平板上培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞懸浮聚集而形成的腫瘤細(xì)胞球[5]；②基于支架的3D 腫瘤模型（scaffold based 3D cancer models），即細(xì)胞或細(xì)胞簇嵌在模擬腫瘤體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)支架的腫瘤模型，其中研究較為廣泛的有類器官（organoids）[6]和基于支架的多種細(xì)胞共培養(yǎng)模型；③腫瘤芯片（tumor on a chip），結(jié)合了能模擬體內(nèi)生物物理微環(huán)境微流體技術(shù)的3D 腫瘤模型[7]。在眾多體外培養(yǎng)3D 腫瘤模型中，類器官可模擬腫瘤體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，且操作較為簡單。這些特性使腫瘤類器官模型成為近年來的研究熱門。類器官是指在體外環(huán)境下，由有自我組織和自我更新能力的干細(xì)胞分化發(fā)育而來的，具有多種細(xì)胞類型的能模仿原組織器官結(jié)構(gòu)功能的三維結(jié)構(gòu)。常見的腫瘤類器官來源有二，一是腫瘤組織直接培養(yǎng)（腫瘤干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞）[8]；二是來源于經(jīng)基因編輯技術(shù)處理的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）培養(yǎng)成的腫瘤類器官模型[9]。iPSC 的腫瘤類器官模型的產(chǎn)生效率取決于腫瘤類型以及該腫瘤是否存在特定的致癌突變，且大概率會導(dǎo)致選擇性的腫瘤亞克隆生長和腫瘤遺傳異質(zhì)性的喪失，通常只用于研究特定基因突變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。而直接由腫瘤組織培養(yǎng)形成的腫瘤類器官可保留腫瘤異質(zhì)性，比涉及基因編輯的iPSC 類器官培養(yǎng)似乎更為實(shí)用[10]，來源于腫瘤組織的類器官保持了親本腫瘤的遺傳特性，在腫瘤研究中更有個(gè)體代表性[6]?，F(xiàn)探討腫瘤類器官模型在腫瘤研究中的具體應(yīng)用。

1 類器官的臨床前應(yīng)用

1.1 建立活體腫瘤類器官生物樣本庫（Biobank）生物樣本庫是一個(gè)儲存和管理用于研究的生物樣本的倉庫。最早是Hans Clevers 團(tuán)隊(duì)在2015 年建立的20多例結(jié)直腸癌組織與臨近正常組織配對構(gòu)成的類器官的生物樣本庫[11]。類器官培養(yǎng)物僅由上皮細(xì)胞組成，對生物樣本庫內(nèi)類器官樣本進(jìn)行基因檢測及其表達(dá)分析，不會像直接對腫瘤組織進(jìn)行檢測一樣受到間質(zhì)、血管和免疫細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞的污染。匹配正常組織的全外顯子組測序，Hans Clevers 團(tuán)隊(duì)觀察到腫瘤類器官生物樣本庫中抑癌基因結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、F 框/WD-40 域蛋白7（F-box and WD-40 domain protein 7，F(xiàn)BXW7）和SMAD家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）的失活改變，在鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS；密碼子12 和146）和磷脂酰肌醇3 激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA；密碼子545 和1047）中的激活突變，類器官生物樣本庫總體突變分析結(jié)果與既往發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌的常見突變一致[11]。除了能保留原腫瘤的遺傳學(xué)特性，腫瘤類器官還可模擬腫瘤在體內(nèi)的形態(tài)結(jié)構(gòu)[12-17]。在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和卵巢癌等多種腫瘤中，配對類器官及腫瘤組織病理學(xué)鑒定都顯示出類器官對原腫瘤形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)的準(zhǔn)確模擬。1 例來源于宮頸透明細(xì)胞癌的類器官經(jīng)液氮凍存后再次培育，也能維持原有的形態(tài)學(xué)特性[12]。在卵巢癌的類器官研究中還觀察到，類器官對同一患者體內(nèi)不同癌灶遺傳異質(zhì)性的保留，即同一個(gè)體不同病灶來源的腫瘤類器官包含不同的突變，并且在體外長時(shí)間的傳代后，類器官和對應(yīng)的癌灶在突變水平上仍然保持高度相似[17]。從上述研究結(jié)果中看出，腫瘤類器官保留并包含了對應(yīng)腫瘤的染色體拷貝數(shù)變異和體細(xì)胞突變，且純度更高，建立腫瘤類器官生物樣本庫有利于保存各類腫瘤的遺傳學(xué)特征，包括罕見的腫瘤遺傳變異譜。將腫瘤類器官生物樣本庫與正常組織對比可篩選潛在的腫瘤標(biāo)志物[18]。既往的腫瘤生物樣本庫分析的大部分樣本來自原發(fā)部位腫瘤的手術(shù)切除標(biāo)本，這就意味著不適宜手術(shù)治療的晚期腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤等重要樣本難以收集入庫。而越來越多的研究表明，穿刺活檢組織甚至是胸腹水中獲得的腫瘤細(xì)胞可建立類器官，并擴(kuò)大培養(yǎng)[8，19-21]，擴(kuò)大化的腫瘤樣本來源更有利于生物樣本庫的多樣化，利用腫瘤類器官生物樣本庫可建立更全面的腫瘤發(fā)生發(fā)展譜。與PDX 模型比較，類器官培養(yǎng)周期短，體外培養(yǎng)可長期擴(kuò)展、凍存復(fù)蘇，且可進(jìn)行高通量的檢測（藥物篩選），建立腫瘤類器官生物樣本庫，可靈活取用分析其中多樣的腫瘤類器官，更有利于進(jìn)行腫瘤分子學(xué)背景與腫瘤生物學(xué)行為（如臨床病理特征、藥物反應(yīng)或耐藥關(guān)系等）模式分析，促進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)治療發(fā)展。與體外2D 細(xì)胞培養(yǎng)面臨相同的問題，長時(shí)間的單一培養(yǎng)條件是否會造成類器官“克隆漂變（clonal drift）”仍需更多的實(shí)驗(yàn)探索[8]。

1.2 類器官與個(gè)體化治療PDX 是現(xiàn)有較成熟的個(gè)體化治療預(yù)測模型，在組織病理學(xué)、分子生物學(xué)和基因水平上保留了大部分原腫瘤的特點(diǎn)，對原腫瘤有較高的代表性，且在體外進(jìn)行的藥物敏感性測試結(jié)果和患者的臨床治療反應(yīng)有較高的一致性，然而不可否認(rèn)的是，PDX 模型的異種移植免疫排斥、耗時(shí)長（6～8 個(gè)月）、費(fèi)用高等的缺點(diǎn)限制了其廣泛應(yīng)用[22-23]。而同樣是患者來源的類器官是體外培養(yǎng)的3D 腫瘤模型，不需要在異種免疫缺陷鼠上進(jìn)行腫瘤移植生長，可以較好地規(guī)避這些限制。既往的卵巢癌類器官研究將類器官解離后，在加入化療藥物的培養(yǎng)條件下進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，判定類器官對藥物的敏感性，結(jié)果顯示高級別漿液性腫瘤來源的類器官對基于鉑類的化療敏感，而非高級別漿液性腫瘤來源的類器官對鉑類化療則表現(xiàn)出相對耐藥的趨勢。與配對的卵巢癌患者的臨床反應(yīng)一致[17]。在靶向治療療效判定上，Smith 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)KRAS 突變的結(jié)直腸癌類器官對西妥昔單抗有耐藥性，而KRAS 野生型的結(jié)直腸癌類器官則對西妥昔單抗無耐藥性[24]。復(fù)旦大學(xué)上海腫瘤中心從新輔助放化療局部晚期直腸癌患者取樣培養(yǎng)出80 例類器官，體外對類器官進(jìn)行放化療，發(fā)現(xiàn)類器官的放化療敏感性與患者的放化療反應(yīng)高度匹配，準(zhǔn)確度為84.43%，敏感度為78.01%，特異度為91.97%[25]。以上均提示患者來源的腫瘤類器官有預(yù)測腫瘤患者化療、放療及靶向治療等反應(yīng)的潛能?；颊邅碓吹哪[瘤類器官能否準(zhǔn)確反映患者的臨床反應(yīng)還需要更多的隊(duì)列研究來驗(yàn)證。一項(xiàng)包含了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的大規(guī)模前瞻性觀察隊(duì)列研究（NL49002.031.14）在荷蘭癌癥研究所開展[26]，這將為研究者們更客觀看待類器官在腫瘤藥物篩選和預(yù)測患者治療反應(yīng)等精準(zhǔn)治療中的作用提供依據(jù)。

2 類器官在基礎(chǔ)腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 利用類器官進(jìn)行大規(guī)模的抗癌藥物研發(fā)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室腫瘤藥物研發(fā)首先是在2D 體外模型（如腫瘤細(xì)胞系）中觀察藥物處理對癌細(xì)胞增殖的影響，大批量地篩選新型抗癌藥物，確定潛在的抗癌藥物后，研究通常需要過渡到PDX 模型，研究藥物在體內(nèi)模型中的藥效及安全性[27-28]。事實(shí)上，進(jìn)入腫瘤臨床試驗(yàn)的臨床前藥物大約85%未能表現(xiàn)出在篩選階段體現(xiàn)的安全性和有效性[29]。這一數(shù)字提示既往腫瘤藥物篩選模型的局限性：2D 腫瘤細(xì)胞系在體外選擇性培養(yǎng)環(huán)境中無法保留原腫瘤遺傳特性及相應(yīng)的腫瘤微環(huán)境[1，4]。Dhimolea 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，相較于腫瘤類器官，體外培養(yǎng)的2D 腫瘤細(xì)胞對藥物的耐受性較低，在同劑量的化療藥物處理下，2D 腫瘤細(xì)胞更早出現(xiàn)凋亡，在同樣的處理時(shí)間下，2D 腫瘤細(xì)胞的存活率也更低，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示類器官的3D 結(jié)構(gòu)會影響體外腫瘤藥物敏感性的檢測。雖然具有腫瘤3D結(jié)構(gòu)的PDX 模型對腫瘤有代表性，但其培養(yǎng)周期及檢測效應(yīng)期較長，常用的PDX 模型藥物敏感性檢測指標(biāo)（如異種移植物大小或小鼠生存時(shí)間等）不適于高通量檢測[22-23]，因此，需要一個(gè)能更好復(fù)制人類腫瘤復(fù)雜性且適用于高通量檢測的腫瘤模型來進(jìn)行藥物篩選。多項(xiàng)前期研究提示，在臨床前應(yīng)用中，腫瘤類器官模型的藥物敏感性檢測與配對患者的一致性較高[14，16，18，20-21]。Vlachogiannis 等[31]對71 例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌進(jìn)行類器官培養(yǎng)和體外藥物敏感性檢測，匹配體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果和患者臨床治療反應(yīng)顯示體外類器官藥物敏感性能達(dá)到100%的敏感度和93%的特異度。

利用類器官進(jìn)行藥物敏感性檢測時(shí)，多數(shù)研究采用對經(jīng)藥物處理后的類器官進(jìn)行細(xì)胞活力檢測的方法，計(jì)算半抑制濃度（IC50）和曲線下面積，評估類器官對藥物是否敏感[13-14，16，18，20-21]。還有研究將經(jīng)藥物處理后的類器官注入免疫缺陷小鼠體循環(huán)/腎囊下，通過觀察形成的患者來源類器官異種移植物（patient derived organoids xenografts，PDOX）體積、轉(zhuǎn)移和生存情況等來評價(jià)藥效[31]。為了更有效地篩選藥物，Jabs 等[32]為卵巢癌類器官開發(fā)了一種基于自動顯微鏡的DeathPro 分析法，一方面，該分析法利用不同的染色方法將活細(xì)胞與死細(xì)胞分開，并在連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)通過共聚焦顯微鏡分析死細(xì)胞（PI 染色）和所有細(xì)胞（Hoechst 染色）覆蓋的總面積，并計(jì)算半數(shù)致死濃度（LD50）、細(xì)胞死亡曲線下面積（area under curve values for cell death）和增殖抑制情況。另一方面，合并健康組織的類器官培養(yǎng)，如肝臟和腎臟類器官，在檢測藥物對腫瘤細(xì)胞的作用時(shí)，可觀察同種藥物對正常肝臟、腎臟類器官的影響，從而輔助篩選專門針對腫瘤細(xì)胞而不會傷害健康細(xì)胞的抗癌藥物，這能幫助發(fā)現(xiàn)潛在的藥物不良反應(yīng)[33]。直接來源于患者的腫瘤類器官模型結(jié)合高通量技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模藥物篩選是醫(yī)學(xué)邁向個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的重要里程碑。

2.2 類器官在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究結(jié)合CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可以在類器官中研究基因的生物學(xué)功能。已有實(shí)驗(yàn)室將常見的結(jié)腸癌基因突變引入培養(yǎng)中的人腸道干細(xì)胞或源自正常人腸上皮的類器官，包括KRAS、APC、TP53、SMAD4和PIK3CA 基因[34-35]。上述研究中，在敲除了APC 和TP53 基因的人腸道干細(xì)胞發(fā)育成的類器官中發(fā)現(xiàn)了大量非整倍體異形細(xì)胞[34]，將經(jīng)過基因編輯的類器官移植到免疫缺陷小鼠中，發(fā)現(xiàn)類器官在小鼠體內(nèi)發(fā)展為腺癌。這提示APC 和TP53 基因突變在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中具有驅(qū)動作用。而在小鼠的腎臟包囊下植入同樣經(jīng)過基因編輯的類器官后能形成腫瘤，但未能形成轉(zhuǎn)移灶，提示腫瘤侵襲行為可能需要另外的基因參與[35]。上述研究展示了類器官結(jié)合基因編輯技術(shù)對研究驅(qū)動腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因的潛能。除此之外，基于類器官體外培養(yǎng)、操作方便的特性，還可建立病毒感染類器官模型，通過共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬病毒-腫瘤的關(guān)系，如肝炎病毒與肝癌、EB 病毒與鼻咽癌。在類器官模型上模擬從感染到腫瘤形成的過程可能有助于揭示病毒的致癌機(jī)制，并在此過程中找到潛在的抗腫瘤靶標(biāo)。

2.3 腫瘤類器官整合微環(huán)境研究探究細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)等腫瘤微環(huán)境內(nèi)組分相互作用已逐漸成為腫瘤研究熱點(diǎn)，但卻缺乏合適的體外腫瘤微環(huán)境模型。在胰腺癌體外模型研究中，有團(tuán)隊(duì)結(jié)合類器官培養(yǎng)方法和流式細(xì)胞術(shù)開發(fā)表征患者胰腺癌類器官和腫瘤微環(huán)境的多細(xì)胞器官樣共培養(yǎng)模型[36]，該模型包含腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等腫瘤組分，從一定程度上在體外反映了腫瘤與其周圍微環(huán)境的相互作用。Neal 等[37]的研究利用氣液界面（air-liquid interface，ALI）培養(yǎng)法直接培養(yǎng)患者來源的腫瘤組織，利用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞測序等手段驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，肺癌、腎癌和黑色素瘤等腫瘤來源的類器官均能維持原腫瘤的腫瘤微環(huán)境組分（成纖維細(xì)胞基質(zhì)及免疫細(xì)胞種群）。結(jié)合此類類器官中保留的原腫瘤免疫組分的特點(diǎn)，可在體外模擬腫瘤免疫治療。加入納武單抗（nivolumab）可激活類器官中的T 細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)T 細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，在體外檢測患者類器官對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的敏感性，推進(jìn)個(gè)體化免疫治療的發(fā)展[37]。整合腫瘤微環(huán)境的類器官共培養(yǎng)模型將為體外研究腫瘤免疫逃逸、腫瘤免疫治療等多種方向提供助力。

3 結(jié)語與展望

類器官在腫瘤研究中具有不可替代的優(yōu)勢，特別是患者來源的類器官。多項(xiàng)研究表明患者來源的腫瘤類器官可完整模擬原腫瘤組織結(jié)構(gòu)和遺傳特性，在精準(zhǔn)治療中作為臨床前模型，預(yù)測疾病預(yù)后及指導(dǎo)患者治療。然而目前的類器官培養(yǎng)仍存在一些缺點(diǎn)，如無法批量生產(chǎn)、組分單一等。規(guī)范類器官的培養(yǎng)技術(shù)及降低類器官培養(yǎng)成本，實(shí)現(xiàn)類器官上高通量藥物篩選，更好地整合類器官與血管、神經(jīng)和免疫等組分以構(gòu)建完整的腫瘤微環(huán)境體系，這些都將是類器官領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。