鴨圓環(huán)病毒編碼蛋白功能研究進(jìn)展

姚鑫炎，呂志航，張玉倩，張雪蓮，郭莎莎

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus,DuCV）屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，同屬的成員還包括豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）、鵝圓環(huán)病毒（goose circovirus,GoCV）、鴿圓環(huán)病毒（pigeon circovirus,PiCV）和鸚鵡喙羽病病毒（beak and feather diseasevirus,BFDV）等。DuCV是一種環(huán)狀DNA病毒，基因組長(zhǎng)約1.8 kb，分別編碼Rep蛋白、Cap蛋白及ORF3蛋白。目前根據(jù)Cap蛋白序列和全基因組序列系統(tǒng)發(fā)育樹可分為DuCV-1和DuCV-2兩個(gè)基因型，每個(gè)基因型又可分為不同的基因亞型。就當(dāng)今的流行情況來看，DuCV-1比DuCV-2流行范圍要廣泛，同時(shí)，同一基因型的不同基因亞型流行情況又不同，并且不同基因型或基因亞型存在重組。目前，鴨圓環(huán)病毒已廣泛流行于養(yǎng)鴨業(yè)，嚴(yán)重危害了養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。

鴨圓環(huán)病毒?。╠uck circovirus disease,DuCVD）是由DuCV引起的鴨羽毛發(fā)育不良、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和消瘦貧血等臨床癥狀的免疫抑制性傳染病[1]。各日齡和品種鴨均易感，DuCV感染后的鴨子各免疫系統(tǒng)表現(xiàn)為出血、變性、壞死及淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少[2]，造成機(jī)體免疫功能下降，使得機(jī)體繼發(fā)感染或多重感染的概率大大提高。在2003年，DuCV由Hattermann K等[3]在德國首次報(bào)道，隨后在匈牙利、美國、韓國、臺(tái)灣和中國等陸續(xù)報(bào)道該病毒感染病例[4-8]。近十幾年來，我國各省鴨感染圓環(huán)病毒的病例不斷被報(bào)道，劉少寧[9]對(duì)我國養(yǎng)鴨集中省份的36個(gè)鴨群采集343只病、死鴨的病料，結(jié)果顯示，病、死鴨中DuCV的個(gè)體陽性率為81.63%（280/343），群體陽性率為94.4%（34/36）。Liu等[10]對(duì)中國南方3個(gè)省4個(gè)不同品種的鴨進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示總體陽性率為36.91%，且大于4周齡的鴨子比小日齡的更易感。白冰等[11]對(duì)2016—2020年廣東地區(qū)鴨圓環(huán)病毒病流行調(diào)查結(jié)果顯示，DuCV陽性檢出率為23.18%（211/910），其中2019年第3季度檢出率為34.61%。同時(shí)，DuCV與細(xì)小病毒、坦布蘇病毒及鴨疫里默氏桿菌等病原菌混合感染病例趨勢(shì)的不斷增高[12-14]，嚴(yán)重威脅了我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。由于當(dāng)今鴨圓環(huán)病毒仍缺乏合適的宿主細(xì)胞系，且該病毒病尚無較好的預(yù)防措施，臨床感染率又較高，因此，深入研究DuCV的基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白功能有助于對(duì)該病的致病機(jī)理及疫苗研制的研究，以期為DuCV的深入研究及該病的科學(xué)防控提供借鑒。

1 鴨圓環(huán)病毒病原學(xué)特征

DuCV是一種無囊膜，呈二十面體對(duì)稱，病毒直徑為15～16 nm，是鴨類已知最小的病毒。該病毒對(duì)外界環(huán)境抵抗能力較強(qiáng)，一旦感染很難清除。目前除了豬PCV和雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus,CIAV）可在體外培養(yǎng)外，其他圓環(huán)病毒均不能在體外培養(yǎng)，所以對(duì)DuCV的病原學(xué)特征研究十分有限。

2 鴨圓環(huán)病毒基因組結(jié)構(gòu)特征

DuCV基因組長(zhǎng)約1.9 kb，與其他圓環(huán)病毒相似，具有3個(gè)主要開放閱讀框，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF1和ORF2位于病毒鏈的相反方向，分別編碼一個(gè)參與病毒復(fù)制相關(guān)的33.6 kDa的Rep蛋白和一個(gè)具有免疫原性的29.7 kDa的核衣殼蛋白Cap蛋白[3,15]。根據(jù)衣殼蛋白及全基因組序列，DuCV-1又可分為DuC V-1a、DuCV-1b、DuCV-1c和DuCV-1d 4種亞型；DuCV-2可分為DuCV-2a、DuCV-2b和DuCV-2c 3種亞型[16]。

在Cap蛋白基因和Rep蛋白基因之間有個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列被認(rèn)為是病毒DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)[16]。通過序列分析可知，DuCV基因組的Rep和Cap基因的基因間區(qū)域有一個(gè)四倍串聯(lián)重復(fù)序列（quadruple Tandem Repeat,QTR），而在其他圓環(huán)病毒中沒有。而且DuCV-1型和DuCV-2型毒株的QTR存在顯著差異，且各自進(jìn)化保守。進(jìn)一步分析證實(shí)，DuCV-2的QTR為168 nt，由4個(gè)42 nt串聯(lián)重復(fù)單元組成。DuCV-1的QTR長(zhǎng)度為180 nt，包含4個(gè)45 nt長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列和8個(gè)長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列。除了Cap蛋白、Rep蛋白及莖環(huán)結(jié)構(gòu)外，ORF3蛋白序列通常反向嵌套在ORF1的編碼序列中，并被認(rèn)為具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能活性[17]。

3 鴨圓環(huán)病毒編碼蛋白及其功能

3.1 Rep蛋白

Rep蛋白位于圓環(huán)病毒的正義鏈上，由ORF1基因編碼，長(zhǎng)約292 aa。該蛋白的氨基酸同源性較高，通常被認(rèn)為是圓環(huán)病毒復(fù)制所必須的蛋白。Rep蛋白作為滾環(huán)復(fù)制模式中復(fù)制起始酶家族中的一員，該蛋白包含3個(gè)保守氨基酸基序和dNTP結(jié)合的P環(huán)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，Rep蛋白與莖環(huán)結(jié)構(gòu)元件和4個(gè)重復(fù)的六聚體（H1、H2、H3、H4）共同組成圓環(huán)病毒起始復(fù)制的起點(diǎn)[19,20]。賈瑞琳[21]的研究發(fā)現(xiàn)，用熒光定量PCR與免疫組化的方法測(cè)定Rep蛋白第6位氨基酸突變的DuCV感染的櫻桃谷鴨，結(jié)果顯示，Rep蛋白第6位氨基酸突變可減少該病毒在免疫器官的增殖，但該蛋白第18位氨基酸突變則對(duì)病毒的增殖無明顯影響。同時(shí)Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)突變對(duì)雛鴨的致病性無明顯影響。除了Rep蛋白在復(fù)制過程中起重要作用外，研究發(fā)現(xiàn)，DuCV基因組的Rep和Cap的基因間區(qū)域有一個(gè)四倍串聯(lián)重復(fù)序列QTR，熒光素酶報(bào)告基因分析表明QTR作為下游序列元件（downstream Sequence Element,DSE）的多聚腺苷酸信號(hào)能增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，同時(shí)，DuCV的反向遺傳研究發(fā)現(xiàn)，QTR缺失導(dǎo)致病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制顯著缺陷[22]。

核定位信號(hào)（nuclear localization signal,NLS）是一種短的信號(hào)肽，可位于多肽序列的任何部分，一般含有4～8個(gè)氨基酸，且沒有專一性，其可幫助親核蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)作用。Wang等[23]研究結(jié)果表明，DcCV兩種基因型Rep蛋白未含10～37位氨基酸殘基可以取消核定位，而Rep蛋白含244～274位C端NLS則沒有顯著改變其亞細(xì)胞定位，證實(shí)了Rep蛋白N端10-37殘基的NLS具有核靶向活性，這表明Rep蛋白可能在病毒復(fù)制過程中定位到細(xì)胞核中。

3.2 Cap蛋白

Cap蛋白由ORF2基因編碼，位于圓環(huán)病毒的負(fù)義鏈上，為DuCV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，對(duì)病毒入侵和感染具有重要的作用。相關(guān)研究表明，在PCV1、PCV2和BFDV的Cap蛋白的N端有很高比例的堿性氨基酸[24]，并且Cap蛋白N端具有2個(gè)或3個(gè)核定位信號(hào)[25-27]。Xiang等[28]使用在線PROSITE計(jì)算機(jī)程序預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DuCV Cap蛋白的第2個(gè)和第36個(gè)氨基酸殘基之間存在兩個(gè)潛在的NLS，并通過不同截?cái)嗟腃ap序列和EGFP-tagged在體外昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)。結(jié)果表明，在感染Sf9細(xì)胞中表達(dá)Cap和EGFP標(biāo)記的蛋白，在相同條件下，截?cái)郚LS區(qū)的Cap蛋白的表達(dá)水平高于未截?cái)郈ap蛋白表達(dá)量，說明DuCVCap蛋白N端NLS調(diào)控了該蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)，DuCV Cap的第36個(gè)氨基酸殘基有可能作為NLS、DNA結(jié)合信號(hào)（DNAbinding signals,DBSs）和表達(dá)水平調(diào)控信號(hào)，介導(dǎo)Cap蛋白與細(xì)胞核和病毒基因組的關(guān)聯(lián)，Cap蛋白與DNA結(jié)合的能力加上這種蛋白質(zhì)具有核定位信號(hào)，表明它可能負(fù)責(zé)對(duì)病毒基因組核的靶向性。

Cap蛋白作為衣殼蛋白，常被用于血清的制備、疫苗的研發(fā)及血清學(xué)檢測(cè)方法的建立。張興曉等[29]將鴨圓環(huán)病毒Cap基因克隆至桿狀病毒載體，經(jīng)篩選后轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)的蛋白與小鼠制備的多抗具有良好的反應(yīng)原性，為Cap蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。許宗麗等[30]將新城疫的F基因與鴨圓環(huán)病毒的Cap基因均克隆至同一真核表達(dá)載體，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒，并將其制備成為DNA疫苗，結(jié)果顯示，免疫不同的劑量機(jī)體可產(chǎn)生不同效價(jià)的抗體，攻毒保護(hù)率也不一致。Huang等[31]以真核載體pcDNA3.1為基礎(chǔ)，分別編碼Cap基因全長(zhǎng)重組質(zhì)粒、缺失核定位信號(hào)編碼序列的Cap基因重組質(zhì)粒和無NLS但有組織型纖溶酶原激活物分泌信號(hào)肽的Cap基因重組質(zhì)粒，通過測(cè)量Cap蛋白特異性抗體和相關(guān)細(xì)胞因子水平來評(píng)估這3種DNA疫苗的免疫原性，結(jié)果表明，不同亞細(xì)胞形態(tài)的Cap蛋白具有良好的免疫原性，無NLS但有組織型纖溶酶原激活物分泌信號(hào)肽的Cap基因重組質(zhì)粒DNA疫苗表達(dá)的分泌性Cap蛋白可能是一種有前途的疫苗，可以提高對(duì)DuCV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

3.3 ORF3蛋白

DuCVORF3蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的具有凋亡活性的病毒蛋白，序列比較分析結(jié)果表明DuCV在同一基因型內(nèi)，ORF3的同源性達(dá)到95.8%～100%。由于ORF3堿基T/A在236核苷酸上的差異，DuCV-1 ORF3蛋白的翻譯被過早的終止密碼子所終止，因此，DuCV-1的ORF3蛋白C端比DuCV-2的ORF3蛋白C端短20 aa[32]。最新研究表明，與分散在細(xì)胞質(zhì)中的DuCV-1相比，DuCV-2 ORF3蛋白的核定位增強(qiáng)了其凋亡活性，而對(duì)DuCV-1和DuCV-2中ORF3蛋白的凋亡活性分析表明，DuCV-2 ORF3能自我抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡活性。DuCV-2的ORF3蛋白C端20個(gè)殘基包括1個(gè)變異的單組分型NLS，該NLS可調(diào)控蛋白的核定位。通過TUNEL檢測(cè)和流式細(xì)胞儀分析，DuCV-1的ORF3蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平高于DuCV-2的ORF3蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平；截?cái)郉uCV-2 ORF3蛋白C端20個(gè)殘基后表達(dá)，ORF3的凋亡活性會(huì)顯著增高，由此可推斷DuCV-2 ORF3蛋白C端20個(gè)殘基抑制了該蛋白的凋亡活性[33]。Xiang等[18]將ORF3重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，無論在感染后的任何時(shí)間段，重組桿狀病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平均高于野生型桿狀病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的水平。以上研究成果也證明了DuCV ORF3蛋白有可能與DuCV的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而ORF3凋亡活性的差異可能反映了DuCV基因1型和基因2型的致病機(jī)制的差異。以上研究的猜想也符合了目前DuC V-1廣泛的流行，而DuCV-2只是小范圍流行的趨勢(shì)。

4 小結(jié)與展望

鴨圓環(huán)病毒病是一種嚴(yán)重的免疫抑制性疾病，使得機(jī)體繼發(fā)或多重感染。近年來，鴨圓環(huán)病毒與其他病原菌混合感染病例報(bào)道的趨勢(shì)在不斷增加，鴨圓環(huán)病毒病的預(yù)防和治療迫在眉睫。雖然從鴨圓環(huán)病毒發(fā)現(xiàn)至今，研究人員對(duì)該病毒的病原學(xué)、基因組結(jié)構(gòu)和功能、致病機(jī)理及疫苗的研制等進(jìn)行了大量的研究工作，但是目前，對(duì)于預(yù)防DuCV感染還沒有有效的措施，同時(shí)DuCV又缺乏細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)用來在體外增殖分離病毒，這對(duì)DuCV的疫苗的研制帶來了挑戰(zhàn)。過去的十幾年里，研究人員雖然建立了多種檢測(cè)方法，但只是用于臨床樣本的檢測(cè)及監(jiān)控該病毒的遺傳進(jìn)化趨勢(shì)，相關(guān)有效的商品化疫苗還未應(yīng)用于臨床，因此，開發(fā)出安全、有效、特異的鴨圓環(huán)病毒疫苗是防控該病的關(guān)鍵，同時(shí)也為我國養(yǎng)鴨業(yè)提供一份保障。