ICP-MS測(cè)定蟾皮中的重金屬及有害元素及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

趙磊，于卓卉，孫艷濤，李正剛，姜大成，昝珂

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.四平市食品藥品檢驗(yàn)所吉林 四平 136000；3.吉林師范大學(xué)，吉林 四平 136000；4.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥皮[1]。夏、秋季捕捉，剝?nèi)⊥馄?，貼于板上或撐開(kāi)，曬干。蟾皮，有小毒，具有清熱解毒、利水消脹及止咳平喘的功效，用于癰疽、腫毒、瘰疬、腫瘤、疳積腹脹和久咳久喘等疾病。本品始載于《本草綱目拾遺》稱為蟾皮，現(xiàn)已列入《中國(guó)藥典》2020年版四部成方制劑中“本版藥典未收載的藥材和飲片項(xiàng)下”[1]?！蛾兾魇∷幉臉?biāo)準(zhǔn)》2015年版，《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2016年版及《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2018年版等地方標(biāo)準(zhǔn)收錄了該藥材[2-4]。

現(xiàn)階段蟾皮藥材多集中在化學(xué)成分研究，蟾皮化學(xué)成分含有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、吲哚生物堿類、蟾蜍環(huán)酰胺類以及甾體類等成分[6-11]。蟾蜍屬于水陸兩棲類爬行動(dòng)物，蟾蜍多隱蔽在陰暗的地方，蟾蜍的生活習(xí)性可能會(huì)有重金屬及有害元素的富集情況。目前，蟾皮中重金屬及有害元素含量情況，經(jīng)查找文獻(xiàn)，未見(jiàn)有研究報(bào)道。本研究建立了ICP-MS法測(cè)定產(chǎn)蟾皮中鉛、鎘、砷、汞及銅5種重金屬及有害元素含量的測(cè)定方法，根據(jù)測(cè)定結(jié)果采用靶標(biāo)危害系數(shù)法（target hazard quotients，THQ）進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為該藥材的質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)[16]。

1 儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備

MA-093微波消解儀（意大利邁爾斯通公司）；AE-240型電子天平（德國(guó)梅特勒公司，感量0.01mg/0.1mg）；品牌為NexION 350X型ICP-MS聯(lián)用儀（PerkinElmer公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鉛（Pb）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1742-2004）、鎘（Cd）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1721-2004）、砷（As）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1714-2004）；汞（Hg）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1729-2004）、銅（Cu）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1725-2004）、鍺元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1728-2004）、銦元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GSB04-1731-2004）、金 元 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液（批 號(hào)：GSB04-1715-2004）、鉍 元 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液（批 號(hào)：GSB04-1719-2004），上述標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，濃度均為1mg/mL。硝酸為優(yōu)級(jí)純（MERCK公司）；水為超純水。

10批蟾皮藥材（編號(hào)為cp1-cp10），經(jīng)鑒定均為中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）的干燥皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 微波消解樣品方法

消解方法：采用10 min內(nèi)升溫至130℃保持溫度10 min；在20 min內(nèi)升至160℃保持溫度10 min；最后5 min內(nèi)升至180℃后保持溫度20 min。

2.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀設(shè)定參數(shù)

輔助氣流速設(shè)定為1.0 L/min射頻功率為1.6 kW，冷卻氣流量設(shè)定為15.0 L/min，流速為1.1 L/min的氬氣為載氣[12]。

2.3 樣品處理

2.3.1 系列對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取Pb、As、Cu、Cd和Hg單元素對(duì)照品溶液，用2%硝酸溶液分別稀釋成含Pb、As、Cu、Cd和Hg為1g/mL、1g/mL、10g/mL、1g/mL和0.5g/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取Pb、As、Cu、Cd對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用2%硝酸溶液稀釋成含Pb為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL，As為0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL和20ng/mL，Cd為0ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL和10 ng/mL，Cu為0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL的系列不同濃度混合溶液。另精密量取汞對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成含Hg為0 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL和2.5 ng/mL的系列不同濃度溶液[12]。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 測(cè)定同位素63Cu、75As以72Ge作為內(nèi)標(biāo)；測(cè)定同位素202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標(biāo)；測(cè)定同位素114Cd以115In作為內(nèi)標(biāo)[12]。

Ge、In、Bi元素內(nèi)標(biāo)對(duì)照溶液配制：采用2%硝酸溶液稀釋制成Ge、In、Bi元素對(duì)照品濃度均為1 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，即得[12]。

2.3.3 樣品的微波消解處理 取蟾皮樣品剪碎，精密稱定0.5 g，置消解罐（聚四氟乙烯）內(nèi)，加硝酸5 mL，混勻，封緊消解罐，采用設(shè)定的消解程序進(jìn)行微波消解。消解程序完成后，采用恒溫加熱器設(shè)定140℃緩緩加熱消解罐，進(jìn)行趕酸處理，濃縮的消解液約近干時(shí)，將消解液用少量水逐漸轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，精密加入1g/mL的金單元素使用溶液200L，用水稀釋至刻度，混勻，即可。

2.3.4 制備空白溶液 取空白試劑，按照“2.3.3”樣品的微波消解處理操作，制備空白待測(cè)溶液。

2.4 線性考察和檢出限

2.4.1 線性范圍 以Pb、As、Cu、Cd和Hg各元素濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)x，Pb、As、Cu、Cd和Hg各元素與內(nèi)標(biāo)測(cè)量值的比值為縱坐標(biāo)y，各元素分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以空白試驗(yàn)產(chǎn)生的信號(hào)響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（）的3倍所對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度作為儀器的檢出限，得到各元素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測(cè)限見(jiàn)表1。

表1 線性方程、線性范圍和檢出限Table 1 Linear equation,linear range and detection limit

2.4.2 儀器精密度考察 取Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為20 ng/mL、取As標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 ng/mL、取Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為100 ng/mL、取Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5 ng/mL和Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1 ng/mL溶液分別進(jìn)樣6次，計(jì)算各元素響應(yīng)值的RSD范圍在0.97%～1.91%之間，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取處理完的蟾皮（編號(hào)cp1）樣品待測(cè)液，考察0 h、2 h、4 h、12 h、24 h的含量。結(jié)果，計(jì)算各元素含量的RSD范圍在RSD為1.61%～1.98%之間，測(cè)定結(jié)果說(shuō)明樣品在24 h以內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性考察 取同一批蟾皮（編號(hào)cp1）約0.5 g，精密稱定，按照供試品溶液處理方法實(shí)驗(yàn)，取樣品6份測(cè)定。結(jié)果，各元素含量的RSD在1.35%～1.88%之間，測(cè)定結(jié)果說(shuō)明本方法的重復(fù)性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知各元素含量的同一批蟾皮（編號(hào)cp1）約0.25 g，共6份，分別加入約相當(dāng)于樣品中測(cè)定元素含量一半的各元素對(duì)照品稀釋液，操作方法采用“2.3.3”項(xiàng)下樣品的微波消解處理方法，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果的平均回收率范圍在85.58%～111.24%之間；表明Pb、As、Cu、Cd和Hg回收率的RSD的范圍在7.32%～8.29%之間。

2.4.6 樣品的含量測(cè)定 采用“2.3.3”項(xiàng)下樣品的微波消解法處理測(cè)定10批樣品，測(cè)定的含量結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品Pb、Cd、As、Hg和Cu的含量（n=3）Table 2 Contents of Pb、Cd、As、Hg and Cu in 10 batches of samples(n=3)

3 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

THQ由美國(guó)環(huán)保局提出，用于評(píng)估人體攝?。ㄍㄟ^(guò)食物）重金屬風(fēng)險(xiǎn)的方法，本試驗(yàn)采用THQ評(píng)估方法，通過(guò)測(cè)定蟾皮中重金屬及有害元素的含量值對(duì)成人和兒童的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[16]。根據(jù)該指導(dǎo)原則，首先計(jì)算蟾皮的標(biāo)準(zhǔn)THQ：蟾皮無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，地方標(biāo)準(zhǔn)有陜西省藥材標(biāo)準(zhǔn)（2015年版）、江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1989年版）、江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1996年版）、江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2016年版）、寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2018年版）、遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)（2019年版），采用地方標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的蟾皮使用量規(guī)定范圍為口服1～9 g。按公式（1）計(jì)算，公式表示方式見(jiàn)表3。

表3 THQ公式表示方式Table 3 THQ formula representation

根據(jù)公式進(jìn)行評(píng)估，若計(jì)算出的THQ低于蟾皮的標(biāo)準(zhǔn)THQ，則認(rèn)為對(duì)健康未造成明顯影響。成人蟾皮的THQ為0.01，兒童THQ為0.007 5。再根據(jù)公式（1）計(jì)算蟾皮中檢出的重金屬的THQ[16]。結(jié)果見(jiàn)表4

表4 蟾皮中Cd、As、Hg和Cu的THQTable 4 THQ of Cd,As,Hg and Cu in toad skin

根據(jù)THQ評(píng)測(cè)結(jié)果顯示成人蟾皮的THQ均小于0.01，兒童THQ均小于0.007 5。因此，5種重金屬含量對(duì)健康風(fēng)險(xiǎn)較低。

4 討論

本研究建立了ICP-MS法測(cè)定蟾皮中的重金屬及有害元素檢測(cè)方法，對(duì)10批蟾皮進(jìn)行了鉛、砷、汞、鎘和銅的元素測(cè)定，除鉛僅在個(gè)別批次中未有檢出外，其余4種重金屬及有害元素在10批藥材中均有檢出，其中參考藥典植物藥的重金屬及有害元素限值規(guī)定，10批樣品中Hg有3批超出限度值0.2 mg/kg。

采用THQ健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示5種重金屬含量對(duì)健康風(fēng)險(xiǎn)較低。為了保障蟾皮應(yīng)用的安全性，考察重金屬及有害元素均有不同程度檢出及3批汞的檢測(cè)超出限度值。根據(jù)THQ評(píng)測(cè)結(jié)果，5種重金屬含量對(duì)健康雖然無(wú)明顯影響。但考慮到蟾皮的生活習(xí)性因素，亟需建立重金屬及有害元素的監(jiān)測(cè)方法，隨機(jī)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，以保障蟾皮藥材的用藥安全。