間充質(zhì)干細(xì)胞治療結(jié)核分枝桿菌感染的基礎(chǔ)研究進(jìn)展

李越, 程潮江, 王洪生, 吳信峰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 江蘇 南京 210042

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種多能干細(xì)胞，符合干細(xì)胞定義最基本的條件：自我更新和分化潛能[1]。2006年，在國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)的倡導(dǎo)下，MSCs首次被定義了最低分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，即：①貼壁生長(zhǎng)；②表達(dá)相應(yīng)抗原：CD105、CD90、CD73(+)、CD45、CD34、CD14(-)；③成脂、成骨、成軟骨分化潛能[2]。近年來(lái)MSCs主要因其成骨能力而應(yīng)用于組織缺損的重建，而后隨著MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的發(fā)現(xiàn)，更多的研究開(kāi)始向炎癥性腸病、自身免疫性腦炎等非感染性炎癥傾斜[3-4]，即不再過(guò)度強(qiáng)調(diào)其多向分化能力的“干性”(stem)，轉(zhuǎn)而著眼于其免疫調(diào)節(jié)方面的“基質(zhì)性”(stromal)[5]；而隨著研究進(jìn)一步深入，目前已有諸多證據(jù)表明MSCs在治療感染性疾病方面也有其應(yīng)用價(jià)值，表現(xiàn)為對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、分枝桿菌、寄生蟲(chóng)及病毒的廣譜抗菌作用。MSCs既可通過(guò)促進(jìn)以巨噬細(xì)胞為代表的免疫細(xì)胞分泌抗菌肽與關(guān)鍵酶[6-7]，也可通過(guò)細(xì)胞表面受體的表達(dá)使機(jī)體免疫狀態(tài)由抑制向激活轉(zhuǎn)化，并限制過(guò)度的炎癥損傷[8]；其自身也能進(jìn)行表型的轉(zhuǎn)化，在感染的不同階段，分化為促炎的MSC1和抑炎的MSC2，并表達(dá)清道夫受體、分泌促炎或抑炎因子、招募遠(yuǎn)處的MSCs，誘導(dǎo)宿主的免疫狀態(tài)增強(qiáng)，使其既能在規(guī)范、足量的抗菌藥的基礎(chǔ)上輔助殺菌，又能減輕炎癥因子風(fēng)暴，最大限度地誘導(dǎo)宿主免疫狀態(tài)的“升級(jí)”[9]。鑒于此，更有學(xué)者賦予MSCs以新的定義，即“藥物信號(hào)細(xì)胞”[10]。本文試將MSCs在上述細(xì)胞、分子等方面對(duì)結(jié)核分枝桿菌抑制作用的基礎(chǔ)研究及少量臨床研究進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期為臨床抗癆治療提供一定思路。

1 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)特性

目前MSCs的治療證據(jù)主要來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌。Mtb可分泌休眠生存調(diào)節(jié)子(DosR)和熱休克蛋白 X(HSPX)維持休眠；分泌阿拉伯甘露聚糖(LAM)、過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶抑制氧化應(yīng)激的殺傷；合成分枝菌酸形成厚而富含脂質(zhì)的細(xì)胞壁對(duì)抗巨噬細(xì)胞吞噬；分泌抗凋亡蛋白及酪氨酸磷酸酯酶活化因子(PtpA)抑制吞噬溶酶體的形成等。正是以上原因，使得Mtb得以躲避以巨噬細(xì)胞為代表的細(xì)胞吞噬，并抑制其殺傷，阻止細(xì)菌抗原向T細(xì)胞呈遞，使感染趨于慢性化，并介導(dǎo)耐藥結(jié)核菌株的產(chǎn)生[11-12]。

2 MSCs治療Mtb現(xiàn)有的基礎(chǔ)研究

2.1 MSC可分泌促炎因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

PGE2(前列腺素E2)與一氧化氮(NO)：MSC 上的TLR3和TLR4受到PAMP的激活后，可通過(guò)p38-MAPK-COX2通路，酶解巨噬細(xì)胞膜上的花生四烯酸生成PGE2，后者可促進(jìn)呼吸爆發(fā)，增強(qiáng)NO分泌，抑制Mtb在Mc中的生長(zhǎng)，該結(jié)果亦可于膿腫分枝桿菌的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中復(fù)現(xiàn)[13]；PGE2還可維持與放大巨噬細(xì)胞吞噬與殺傷，通過(guò)表達(dá)抗凋亡因子bcl-2抑制其凋亡，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞形成細(xì)胞外網(wǎng)狀陷阱，增強(qiáng)其捕捉與殺傷病原菌的能力[6,14]。

TNF-α、IL-6與IL-1β：受到抗原相關(guān)分子模式(PAMPs)刺激后，MSC1可自分泌TNF-α，激活自身TNFR-TRAF-NF-κb-IL-1β通路，促進(jìn)炎癥進(jìn)展；當(dāng)機(jī)體與病原體之間的免疫狀態(tài)趨于平衡，MSC2再通過(guò)TNFR和B7-H1兩種受體的高表達(dá)，與炎癥微環(huán)境中已有的TNF-α和IFN-γ相結(jié)合，抑制上述NF-κb通路釋放下游產(chǎn)物Jagged-1、IL-6、IL-8，既抑制NK細(xì)胞的成熟，又能進(jìn)一步激活Notch信號(hào)，促進(jìn)DC細(xì)胞向DC-reg表型轉(zhuǎn)化，后者通過(guò)共刺激分子與已經(jīng)活化的M1型巨噬細(xì)胞直接接觸，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2型轉(zhuǎn)化，分泌IL-4、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)T-reg增值，抑制過(guò)度的免疫炎癥，促進(jìn)受損組織的修復(fù)[1,15]。一項(xiàng)關(guān)于牛分枝桿菌(M.bovis)的研究發(fā)現(xiàn)MSCs抗菌作用的實(shí)現(xiàn)需要提前“誘導(dǎo)”：研究者將1×107CFU(菌落形成單位)的M.bovis注射入小鼠腹腔，并將實(shí)驗(yàn)組提前以Poly(A:U)(TLR-3的配體)1.0 μg/mL與待注射的MSCs(7.5×105)孵育誘導(dǎo)成促炎的MSC1表型；發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組肉芽腫形成數(shù)量雖為對(duì)照組1.5倍，但包含分枝桿菌的肉芽腫數(shù)量卻減少了3倍，且每個(gè)肉芽腫內(nèi)的分枝桿菌數(shù)量也減少了3.5倍；CFU計(jì)數(shù)較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TNF-α較對(duì)照組升高20倍，IL-6升高11倍，IL-1β少許升高[15]。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)：也稱(chēng)作CCL2，主要由銀屑病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，近年來(lái)也被證明可由MSCs所分泌；MCP-1可與單核細(xì)胞上的CCR2結(jié)合，將其募集至感染部位，并激活其胞內(nèi)鈣離子通道，促使上述免疫細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、促進(jìn)氮氧化物產(chǎn)生和溶菌酶的釋放[16]。

2.2 MSC可分泌抗菌肽促進(jìn)呼吸爆發(fā)

LL-37：由中性粒細(xì)胞及上皮細(xì)胞產(chǎn)生，為帶正電的雙親性α螺旋肽，可通過(guò)電荷吸引破壞細(xì)菌外膜、與細(xì)菌DNA結(jié)合、抑制蛋白質(zhì)合成、中和LPS、招募巨噬細(xì)胞等作用發(fā)揮廣譜抗感染效應(yīng)[17]。LL-37不僅直接破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，還能與甲酰肽樣受體結(jié)合，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及T細(xì)胞的趨化；通過(guò)P2X7受體被巨噬細(xì)胞內(nèi)化，促進(jìn)胞內(nèi)細(xì)菌的清除，并且這一行為常伴隨活性氧的增加和溶酶體的形成[18]。在急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等諸多疾病模型中，MSCs已被反復(fù)證實(shí)可通過(guò)LL-37的分泌減少細(xì)菌負(fù)荷，改善預(yù)后[19]。有研究向受Mtb感染的巨噬細(xì)胞中加入LL-37后發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路的關(guān)鍵下游產(chǎn)物IL-1β在mRNA水平上表達(dá)上調(diào)，同時(shí)巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物的水平也有所增加[20]。在一項(xiàng)對(duì)Mtb感染小鼠的動(dòng)態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，LL-37的表達(dá)水平在感染后第21天出現(xiàn)峰值，而此時(shí)間段正值Th1細(xì)胞所介導(dǎo)的保護(hù)性免疫達(dá)到最強(qiáng)，因此推測(cè)該時(shí)段高表達(dá)的抗菌肽主要介導(dǎo)了其抗菌作用[16]。LL-37不僅可由MSCs所分泌，還可反向調(diào)節(jié)MSCs的增值與遷移[21]。

β-防御素：β-防御素主要由黏膜上皮細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生，分4型，除β-防御素1外均為誘導(dǎo)性分泌。低氧作為一種對(duì)炎性因子的非特異性反應(yīng)，也可引起β-防御素-2的mRNA 轉(zhuǎn)錄增加，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，減輕LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，刺激MSC遷移、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性[21]。在M.bovis感染模型中，β-防御素-2與分枝桿菌抗原的融合尚可提高卡介苗的接種效果[22]。有研究顯示，轉(zhuǎn)入β-防御素3基因的牛與對(duì)照組相比，氣道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)β-防御素3的表達(dá)顯著增加，其感染M.bovis的風(fēng)險(xiǎn)降低[20]。

鐵調(diào)素：主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，但在炎性病灶處的MSCs、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中也有較高表達(dá)；鐵調(diào)素可通過(guò)與運(yùn)鐵素結(jié)合，促進(jìn)該蛋白的內(nèi)化與降解，從而減少細(xì)胞內(nèi)鐵的輸出，將鐵儲(chǔ)存在巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞內(nèi)，抑制細(xì)菌對(duì)鐵元素的吸收與利用[23]。

2.3 MSC可表達(dá)細(xì)胞表面受體促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬

清道夫受體(SRs)：已知巨噬細(xì)胞中的SRs，如MARCO和CD36，可通過(guò)識(shí)別Mtb細(xì)胞壁上的脂蛋白，介導(dǎo)Mtb的內(nèi)化[24]；而MSCs表面同樣存在上述兩種受體，但是否參與Mtb的吞噬，卻尚未可知。Arshad團(tuán)隊(duì)先后使用兩種不用顏色的熒光，分別標(biāo)記低密度脂蛋白與結(jié)核分枝桿菌，動(dòng)態(tài)孵育24 h后，熒光融合率達(dá)70%；為進(jìn)一步驗(yàn)證MSCs可通過(guò)SRs內(nèi)化Mtb的假設(shè)，作者加入SRs特異性抗體阻斷，導(dǎo)入siRNA行SRs基因敲低，反向證明了其結(jié)論成立[25]。

Toll樣受體和NOD樣受體：有研究者以TLR-4和NOD-2刺激MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs可通過(guò)p38-MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)NF-κB活性，促進(jìn)IL-1β等促炎因子的分泌，并通過(guò)分泌細(xì)胞外囊泡的形式，傳遞結(jié)核分枝桿菌至吞噬細(xì)胞內(nèi)體，參與內(nèi)體與溶酶體的融合，誘導(dǎo)細(xì)菌的溶解[26]。為增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬，MSCs還可形成納米管道，向巨噬細(xì)胞輸送線(xiàn)粒體等細(xì)胞器，增強(qiáng)其代謝活性，促進(jìn)以Mtb、金葡菌為代表的病原菌的吞噬[27]。

2.4 MSC可通過(guò)自噬殺傷結(jié)核分枝桿菌

自噬：通過(guò)熒光追蹤結(jié)核分枝桿菌與自噬體特異性標(biāo)志物Cyto-ID與LC3，檢測(cè)感染Mtb 7 d內(nèi)的MSCs細(xì)胞裂解物中CFU計(jì)數(shù)及干細(xì)胞活力。Khan等[25]證實(shí)，Mtb在MSCs內(nèi)可以復(fù)刻巨噬細(xì)胞中Mtb的自噬殺滅過(guò)程；而沉默自噬啟動(dòng)子Beclin-1的陰性對(duì)照組的CFU上升，則反向證明了MSC的內(nèi)在自噬介導(dǎo)了其殺菌過(guò)程。反之，1～5 μmol范圍內(nèi)的雷帕霉素所誘導(dǎo)的MSC呈劑量依賴(lài)性自噬增強(qiáng)，伴隨CFU的下降及間充質(zhì)干細(xì)胞90%活力的保持。

2.5 MSC可雙向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)

在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中，LPS刺激1 h可將MSC0誘導(dǎo)成促炎的MSC1，于感染的早期表達(dá)TLR3/4、MHCII，提呈抗原，分泌趨化因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞的活化，提前使機(jī)體“戒備”[28]。而LPS刺激48 h或Poly：IC刺激1 h可將MSC0誘導(dǎo)成抑炎的MSC2，于感染的中晚期抑制過(guò)度的炎癥，使免疫損傷局限于病灶，避免炎癥因子風(fēng)暴級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，并分泌一定水平的TGF-β和VEGF，提前修復(fù)組織損傷[29]，最終縮短病程，整體提高以宿主為導(dǎo)向的免疫狀態(tài)，從而在Mtb的早期吞噬、殺傷促進(jìn)，晚期纖維化形成上起到宏觀調(diào)控作用[8]。

2.6 MSC可分泌關(guān)鍵酶抑制結(jié)核生長(zhǎng)

IDO-1(吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1)：MSC1在病原相關(guān)分子模式(PAMPs)的刺激下，可通過(guò)TLR4-STAT2-IDO1通路，促進(jìn)IDO-1分泌，該作用又在IFN-γ和IL-1β的作用下得到加強(qiáng)，從而在感染早期發(fā)揮自主的、廣譜的抗菌作用，但該過(guò)程于小鼠實(shí)驗(yàn)中不能復(fù)現(xiàn)，或?yàn)槿祟?lèi)MSCs所獨(dú)有[30]。而在感染中后期，IDO-1持續(xù)裂解色氨酸，后者作為分枝桿菌生物合成的關(guān)鍵底物，因而持續(xù)性消耗，抑制其增殖；另外，控制細(xì)菌生長(zhǎng)所消耗的色氨酸水平明顯低于抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)之所需，這表明在細(xì)菌感染的早期階段，IDO的分泌是針對(duì)對(duì)抗微生物而非激起炎癥因子瀑布[31]。而其酶解產(chǎn)物犬尿氨酸作為經(jīng)典的抑炎分子，可抑制NK細(xì)胞、DC細(xì)胞的活化與增值，并促進(jìn)Treg的增值，從而平衡過(guò)度的Th1型免疫反應(yīng)，限制炎癥的爆發(fā)[15]。

3 MSC治療結(jié)核分枝桿菌現(xiàn)有的臨床研究

為尋求治療多重耐藥與泛耐藥結(jié)核的新方法，有研究在標(biāo)準(zhǔn)抗癆藥治療4周的基礎(chǔ)上，輔以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單次(1×106/kg)靜脈輸注，觀察6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)：①感染者自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記符合上述MSCs分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)；②21例患者胸部X線(xiàn)征象于總體上較前改觀，其中16例治愈，5例好轉(zhuǎn)；③治療組患者外周血γ-IFN水平較基線(xiàn)升高，與生理鹽水對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[32]。該研究對(duì)36例已有抗癆藥物覆蓋的多重耐藥結(jié)核患者行單次MSCs靜脈輸注后行臨床觀察，治療組中有29例(81%)患者獲得了臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)及影像學(xué)上的改善，75%的患者獲得治愈，且均未觀察到明確的不良反應(yīng)；而對(duì)照組中，僅14例(39%)改善，卻有16例(44%)治療失敗(臨床癥狀無(wú)改善、痰涂片仍陽(yáng)性或胸片病灶無(wú)縮小)。有趣的是，在連續(xù)5次痰涂片轉(zhuǎn)陰的觀察過(guò)程中，治療組與對(duì)照組的差異隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸縮?。篗SCs輸注后4個(gè)月，60.6%的治療組痰涂片轉(zhuǎn)陰，而對(duì)照組為43.8%；輸注后6個(gè)月，二者的轉(zhuǎn)陰率為71.9%和71.4%，差異已不再有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[33]?？赡艿K于痰涂片本身陰性率高，且該結(jié)果與臨床表現(xiàn)、胸片結(jié)果不平行，研究者并未進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)語(yǔ)

MSCs作為細(xì)胞治療的一種手段，在機(jī)制上可通過(guò)直接、間接的方式，在感染的不同時(shí)期，分別發(fā)揮促炎和抑炎的作用，綜合調(diào)控機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，使整體的免疫狀態(tài)由抑制向活躍轉(zhuǎn)化。但是，目前關(guān)于MSCs治療結(jié)核感染的臨床實(shí)驗(yàn)僅有兩項(xiàng)，且治療效果的評(píng)估均建立在足量、規(guī)范的抗癆藥物基礎(chǔ)之上，在MSCs大規(guī)模應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，仍然需更多高級(jí)別的證據(jù)對(duì)其安全性及有效性加以佐證。