穿心蓮內(nèi)酯對HL－60細(xì)胞凋亡、CytC蛋白表達(dá)的影響

石靜梁勇剛山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院解剖研究室，山西　汾陽　032200

穿心蓮內(nèi)酯對HL－60細(xì)胞凋亡、CytC蛋白表達(dá)的影響

石靜梁勇剛
山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院解剖研究室，山西汾陽032200

【摘要】目的:研究穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)人HL－60細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制。方法:以人早幼粒白血病細(xì)胞株HL－60為模型，作用于HL －60細(xì)胞的穿心蓮內(nèi)酯設(shè)3.125、6.25、12.5μg/ml三個受試濃度，實驗分為溶媒對照組、穿心蓮內(nèi)酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四個組。采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色檢測穿心蓮內(nèi)酯對細(xì)胞色素C(CytC)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:穿心蓮內(nèi)酯能促進(jìn)HL－60細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h，CytC蛋白表達(dá)增加，12.5μg/ml作用濃度與溶媒對照相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:穿心蓮內(nèi)酯能誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能與CytC釋放的增加、線粒體通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】穿心蓮內(nèi)酯;細(xì)胞凋亡; CytC

1　材料和方法

1.1細(xì)胞購置及培養(yǎng)人早幼粒白血病HL－60細(xì)胞株購于武漢大學(xué)細(xì)胞保存中心。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基放置在常規(guī)培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2樣品配置及實驗分組根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，作用于HL －60細(xì)胞的穿心蓮內(nèi)酯(購自天津天士力制藥股份有限公司)設(shè)3.125、6.25、12.5μg/ml 3個受試濃度。用DMSO溶解穿心蓮內(nèi)酯為50mg/ml貯存液，所需濃度在實驗前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋生成。實驗分為溶媒對照組、穿心蓮內(nèi)酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四個組。

1.3流式細(xì)胞儀檢測穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h凋亡率把對數(shù)生長期的HL－60細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106 個/ml，以1ml/孔接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯，作用24h后離心收集細(xì)胞，PBS液洗滌細(xì)胞兩次，按照Annexin V/PI雙染法(試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司)步驟操作，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果用WinMDI version2.9軟件進(jìn)行分析。

1.4熒光標(biāo)記/流式細(xì)胞術(shù)檢測Cytc蛋白的表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)、接種、加樣品同上。穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60 24h后收集細(xì)胞，800rpm離心5min后，用250μl PBS液清洗2次后重懸細(xì)胞于流式管中，加入20μl熒光標(biāo)記的Cytc(購自Abzoom公司)，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，用x± SD表示所有實驗數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h凋亡定量檢測結(jié)果顯示，和溶媒對照相比，穿心蓮內(nèi)酯各濃度作用于HL－60 24h后，各組細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率均隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的升高逐漸升高，量效關(guān)系明顯;與溶媒對照相比，中、高濃度早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

3.2穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h CytC蛋白表達(dá)變化

結(jié)果表明，與溶媒對照相比，不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h后，CytC蛋白表達(dá)逐漸增加，表明穿心蓮內(nèi)酯作用后CytC從線粒體膜間隙釋放到胞漿內(nèi)的量逐漸增加。見表2。

表1　穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h凋亡定量檢測情況表(±sD)

表1　穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h凋亡定量檢測情況表(±sD)

注:與溶媒對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量(μg/ml)早期凋亡率(%)　晚期凋亡率及壞死率(%)溶媒對照/　2.66±1.01　1.85±0.67穿心蓮內(nèi)酯3.125　6.17±0.72　3.68±1.09 6.25　16.28±1.98*　28.43±4.57*12.5　29.16±9.56*　70.27±9.78*

表2　穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h CytC蛋白表達(dá)情況表

4　討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，可發(fā)生在任何年齡段，發(fā)病率高，預(yù)后不良。不斷發(fā)掘療效好、毒副作用低的抗癌中草藥是研究的新方向。

筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可以抑制人SKOV3、A431、HL－60細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)SKOV3、A431細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡可能與線粒體膜電位(MMP)下降有關(guān)[1－2]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測穿心蓮內(nèi)酯是否能誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色檢測穿心蓮內(nèi)酯對HL－60細(xì)胞細(xì)胞色素C(CytC)蛋白表達(dá)的影響。

Annexin/PI雙染法FCM檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯能促進(jìn)HL－60細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性; 6.25、12.5μg/ml與溶媒對照組相比，早期凋亡率、晚期凋亡率及壞死率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，其中最常見的就是線粒體通路。由該通路啟動的細(xì)胞凋亡過程受許多蛋白質(zhì)的調(diào)控，以CytC最常見。

CytC是位于正常細(xì)胞的線粒體內(nèi)、外膜之間。在細(xì)胞凋亡信號刺激下，CytC可從細(xì)胞的線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞的胞漿，這是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵步驟。在各種刺激因素作用下，線粒體外膜通透性增加、線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)持續(xù)性開放、MPP逐漸降低，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放后，線粒體基質(zhì)會腫脹，線粒體外膜更易破裂，釋放出細(xì)胞色素C等膜間蛋白，最終引起細(xì)胞凋亡[3]。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯作用HL－60細(xì)胞24h后，CytC蛋白表達(dá)增加，且高濃度(12.5μg/ml)與溶媒對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。這一現(xiàn)象表明:穿心蓮內(nèi)酯作用下，可能使HL－60細(xì)胞線粒體膜通透性增高，從而使膜間隙蛋白CytC釋放增加[4]。

總之，本研究結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯能誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞的凋亡。我們對其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，在此過程中CytC蛋白釋放增加，進(jìn)而提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)HL－60細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

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[2]石靜，梁勇剛．穿心蓮內(nèi)酯對人皮膚基底細(xì)胞癌A431細(xì)胞生長、凋亡及增殖細(xì)胞核抗原蛋白表達(dá)的影響[J]．解剖學(xué)報，2013，44(1): 73 －78．

[3]石靜，卿晨．線粒體膜電位改變與細(xì)胞凋亡[J]．中國民族民間醫(yī)藥，2011，20(7): 20－21．

[4]蔣時紅，吳耀松，劉燕，等．胃康舒寧促胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制與線粒體凋亡途徑[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，21: 203－206．

收稿日期:( 2014.12.17)

【文章編號】1007－8517(2015)03－0022－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R285.5