賴氨酰氧化酶樣蛋白 1在癌癥中作用機制的研究進展

李 彬，王播勇，王雨娜，楊 娜，自加吉，余 敏，普元倩，熊 偉

1 大理大學基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，云南省高校臨床生物化學檢驗重點實驗室，云南大理 671000；2 云南大學生命科學學院 生物化學與分子生物學實驗室，云南昆明 650091

賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族是分泌型的銅依賴性胺氧化酶，由5個成員構成，即LOX、賴氨酰氧化酶樣蛋白1 ～ 4(lysyl oxidase like 1-4，LOXL1-4)[1-2](圖1)。LOX蛋白家族的成員具有一個共同的保守C端結構域和一個可變的N端前區(qū)域。C端結構域包含銅離子結合位點、賴氨酰酪氨酸醌和細胞因子受體樣結構域，是其發(fā)揮交聯(lián)膠原蛋白和彈性蛋白催化活性所必需的結構[3]。LOX家族成員N-末端序列具有多樣性，LOX和LOXL1含有前結構域，LOXL2 ～ 4組成該家族的一個亞組，參與細胞黏附和蛋白質-蛋白質相互作用。LOX家族蛋白質N-末端從第1位氨基酸開始約20個氨基酸殘基通常為信號肽序列，對LOX蛋白的分泌有重要的影響。LOX和LOXL1都含有前導序列，這使得它們可作為無活性的酶原分泌。酶原直接與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相互作用，使酶沉積于彈性組織[4]。LOX家族成員的催化結構域非常相似，可能以相似的方式發(fā)揮作用[5]。LOX家族蛋白參與膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)，以及機體發(fā)育、損傷、纖維化和癌癥發(fā)生過程中的基質重塑[6]。LOX和LOXL1均參與膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)，LOXL1的異常表達是許多與ECM合成或降解失衡相關病理過程的基礎。本文主要綜述LOXL1蛋白的結構、功能及其與癌癥發(fā)生發(fā)展的關系，進一步探討LOXL1蛋白在癌癥研究中的應用前景，為癌癥的臨床診斷與治療提供理論基礎和參考依據(jù)。

圖1 LOX家族蛋白質的結構同源性Fig.1 Structure homology of LOX family proteins

1 LOXL1蛋白的結構與功能

LOXL1基因定位于15q24.1，其編碼的蛋白質分子量為63 kU。LOXL1基因在主動脈、胎盤、骨骼肌、腎和胰腺中含量最高，這表明LOXL1可能參與維持這些組織結構的完整性[7]。LOXL1在細胞內為90 kU的前體酶原[2]。在其N端信號肽被切割后，LOXL1作為一種前酶在細胞外分泌。分泌型前LOXL1通過其N端前肽結構域結合原彈性蛋白和纖維蛋白-5的C端，定位于彈性發(fā)生部位[8]。纖維蛋白-5的作用是將前LOXL1栓系到原彈性蛋白[9]。LOXL1在彈性發(fā)生中起關鍵作用，基因突變將導致皮膚松弛和年齡相關性黃斑變性[10]。LOXL1富含賴氨酸的前肽區(qū)域對原彈性蛋白具有最高的親和力，并通過蛋白質-蛋白質相互作用促進前LOXL1的正確定位和功能。前酶被前膠原C蛋白酶-骨形態(tài)發(fā)生蛋白1切割以進行催化活化[11]。此外，DNA甲基化、長鏈非編碼RNA、微小RNA和組蛋白修飾均參與LOXL1基因的表達調控。Zeltz等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1還受整聯(lián)蛋白α11調節(jié)。環(huán)境因素如缺氧、氧化應激和紫外線照射等也可改變LOXL1的表達，這些遺傳和環(huán)境因素的結合也可能會影響疾病的發(fā)展。

LOXL1蛋白可以在機體損傷、纖維化疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中促進彈性蛋白的成熟和ECM的重塑，主要機制是將可溶性彈性蛋白單體聚合成彈性蛋白聚合物[9]。最近的研究表明，LOXL1在膠原蛋白的形成中發(fā)揮作用，協(xié)助維持ECM的平衡[13]。在人類青光眼小梁網(wǎng)細胞中，LOXL1活性的增加有助于彈性蛋白基質積累[14]。假性剝脫綜合征患者體外培養(yǎng)的人Tenon囊成纖維細胞顯示彈性蛋白的表達增加與LOXL1水平相關[15]。此外，一項對大鼠胎肺成纖維細胞的體外研究表明，LOXL1在彈性蛋白沉積過程中與彈性蛋白基質結合。LOXL1還被證明與體內彈性纖維的功能密切相關。LOXL1基因敲除的小鼠出現(xiàn)多種彈性組織異常，包括皮膚松弛增加、腹主動脈瘤、腸憩室、肺氣腫以及盆腔和生殖道脫垂[16-19]。這些現(xiàn)象表明了LOXL1蛋白在ECM穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了至關重要的作用，在彈性蛋白的成熟方面尤為顯著。LOXL1蛋白的其他作用也被提出，如抑制或促進癌癥發(fā)生，進一步闡明LOXL1的功能和機制可以為癌癥治療提供新的思路。

2 LOXL1蛋白在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用

研究表明，LOXL1蛋白在各種癌癥組織和細胞系中呈現(xiàn)不同的表達。與對應癌旁組織或正常組織相比，LOXL1在結直腸癌(colorectal cancer，CRC)[20]中表達顯著降低，而在涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)[21]、肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)[22]、惡性胸膜間皮 瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)[23]、腦膠質瘤(brain glioma，BG)[24]、前列腺癌(prostate cancer，PC)[25]、胃癌(gastric cancer，GC)[26]、腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)[27]、膀胱癌(bladder cancer，BC)[28]組織中表達顯著升高。

2.1 LOXL1與結直腸癌 CRC是常見的惡性腫瘤之一，包括直腸癌和結腸癌。Hu等[20]的研究表明，與正常結直腸癌組織相比，LOXL1在結直腸癌組織中低表達。在體外，沉默LOXL1基因的CRC細胞系顯著增強了遷移、侵襲和集落形成的能力，而LOXL1基因的過表達發(fā)揮了相反的作用。體內實驗結果表明，LOXL1在CRC細胞中過表達顯著抑制腫瘤生長和轉移進展。機制上，LOXL1通過與正蛋白激酶1/2(mammalian sterile20-like kinase 1/2，MST1/2)相互作用激活MST1/2的磷酸化，進而抑制Yes相關蛋白基因的轉錄。然而，Sun等[29]從美國國家癌癥基因組圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取數(shù)據(jù)并通過ULCAN數(shù)據(jù)庫進行在線分析，發(fā)現(xiàn)LOXL1和LOXL2基因在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，亞組分析表明在直腸腺癌組織與正常組織中LOXL1基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義。以上兩個研究從不同方面討論了LOXL1在CRC中的作用，由于側重不同，產生了不同的結論，由于癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個極為復雜的過程，受多種因素共同作用及調控，因此深入了解LOXL1對CRC的影響對后續(xù)診斷及治療CRC有重大意義。

2.2 LOXL1與涎腺腺樣囊性癌 SACC是最常見的涎腺惡性腫瘤，約占所有涎腺惡性腫瘤的22%[30]?；騿幼由螩pG島的高甲基化導致轉錄抑制。Bell等[21]的研究分析了16例配對的正常組織和腫瘤組織的異常 DNA 甲基化，通過微陣列分析確定了腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)組織中32個高甲基化和7個低甲基化的差異甲基化CpG島。在LOXL1等5個基因附近的CpG島上存在低甲基化現(xiàn)象。在14個主要編碼轉錄因子的基因和13個功能不同的基因附近發(fā)現(xiàn)了高甲基化。此外，與正常組織相比，腫瘤組織中的高度甲基化基因與發(fā)育、凋亡和其他基本細胞途徑有關，提示這些基因的下調與ACC的發(fā)展和進展有關。CpG甲基化在包括衰老、傳染病和癌癥在內的一系列生物過程中起著重要的基礎作用。評估癌癥相關基因中CpG島甲基化狀態(tài)可為SACC的臨床診斷和治療提供理論基礎和參考依據(jù)。

2.3 LOXL1與非小細胞肺癌 NSCLC是肺癌的一種，占肺癌的80%。整聯(lián)蛋白α11是一種基質膠原受體，促進NSCLC的腫瘤生長和轉移，并與腫瘤ECM中膠原的調節(jié)有關。Zeltz等[22]研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1在整聯(lián)蛋白α11缺乏的小鼠中下調。進一步研究LOXL1與整聯(lián)蛋白α11關系以及LOXL1在NSCLC中的致瘤作用，通過對患者數(shù)據(jù)的集中研究，結果表明LOXL1和整聯(lián)蛋白α11的表達是相關的，并證實整聯(lián)蛋白α11的缺乏能夠下調基質細胞中LOXL1的表達。使用基因敲除LOXL1或過表達LOXL1的癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblast，CAF)，在體外證實了LOXL1在膠原基質重塑和膠原纖維排列中的作用，在體內證實了LOXL1在NSCLC異種移植模型中的致瘤作用。NSCLC腫瘤基質中膠原重塑的結果顯示，LOXL1蛋白促進了NSCLC生長和進展。在整聯(lián)蛋白α11的表達調控下，基質LOXL1是NSCLC發(fā)生的決定因素，也可能是NSCLC的一個治療靶點。Lee等[31]的研究表明，與NSCLC原發(fā)部位相比，LOXL1、單羧酸轉運體1/2(mono carboxylate transporter 1/2，MCT1/2)和基質金屬蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase 2/9，MMP2/9)在轉移部位呈過表達[31]。過表達LOXL1基因在體內和體外均能夠誘導肺癌細胞的轉移，而通過siRNA敲低LOXL1基因能夠抑制肺癌細胞的轉移和侵襲。MCT1/2通過乳酸積累降低細胞外酸性環(huán)境pH值并高度激活MMP2/9蛋白表達，進而參與LOXL1相關的癌癥轉移[31]。這項研究表明LOXL1蛋白可作為抑制惡性腫瘤轉移的潛在藥物靶點。

2.4 LOXL1與惡性胸膜間皮瘤 MPM是一種高度侵襲性腫瘤，發(fā)生于覆蓋肺部的胸膜間皮組織[32]。眾所周知，MPM的發(fā)病主要是由于工業(yè)環(huán)境中的石棉暴露[33]。Kim等[23]利用腫瘤公共數(shù)據(jù)庫進行了生物信息學篩查，確定了幾個可能作為MPM生物標志物的候選基因。通過定量聚合酶鏈反應，對9例正常胸膜組織和40例MPM組織樣本的潛在腫瘤標志物進行分析，結果表明LOX、LOXL1、LOXL2和鋅指蛋白FOG家族成員2(zinc finger protein, FOG family member 2，ZFPM2)是MPM的潛在診斷標志物。研究還發(fā)現(xiàn)，LOX蛋白家族和ZFPM2具有與纖維蛋白-3(fibulin-3)或間皮素(mesothelin，MSLN)相同的診斷能力，相比硫酸酯酶1(sulfatase 1，SULF1)、血小板反應蛋白2(thrombospondin 2，THBS2)和鈣黏蛋白11(cadherin 11，CDH11)更適合作為潛在生物標志物。因此，LOX蛋白家族和ZPFM2可作為新的MPM診斷生物標志物，為MPM的臨床診斷提供更有利的參考依據(jù)。最近，我們的研究通過RTqPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與配對正常胸膜組織相比，12例MPM組織中LOXL1和LOXL2基因mRNA的表達量均顯著增加[34]。LOXL1和LOXL2基因高表達和腫瘤類型是導致MPM患者預后不良的獨立因素。此外，LOXL1基因與LOXL2、LOXL4基因表達呈顯著正相關[34]。

2.5 LOXL1與前列腺癌 PC是男性泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤。在世界范圍內，男性所有惡性腫瘤中前列腺癌的發(fā)病率居第2位，嚴重危害男性健康[24]。LOX和LOXL1是ECM沉積和成熟的關鍵酶。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LOX家族蛋白質在前列腺癌中促進腫瘤進展和轉移，也具有抑制腫瘤的作用。研究顯示，原位植入大鼠前列腺癌AT-1細胞增加了腫瘤和周圍非惡性前列腺組織中的LOX和LOXLs mRNA表達，提示這些酶可能在前列腺癌的進展中發(fā)揮作用。在體外缺氧培養(yǎng)24 h的AT-1細胞中LOX、LOXL1和LOXL2mRNA水平顯著高于常氧對照組，提示大鼠腫瘤組織和非惡性前列腺組織中這些LOX家族酶的上調可能是由于缺氧所致。植入AT-1細胞之前，用β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，BAPN)抑制LOX蛋白表達，可抑制腫瘤生長。相反，在腫瘤形成后開始治療，會導致腫瘤生長不受影響或促進腫瘤生長。此外，當靜脈注射腫瘤細胞時，BAPN治療并不能抑制腫瘤自發(fā)淋巴結轉移的形成。膠原蛋白是LOX的靶點，在腫瘤組織和腫瘤臨近的前列腺組織中可以觀察到膠原纖維含量的暫時性下降，這提示早期BAPN治療在抑制腫瘤生長方面比后期治療更有效。研究結果表明，LOX家族蛋白質的功能與環(huán)境有關，在前列腺癌中分別表現(xiàn)抑制腫瘤和促進腫瘤的特性。抑制LOXL1蛋白作用有望作為前列腺癌治療的一種潛在方式。

2.6 LOXL1與腦膠質瘤 BG約占成人原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%，其特點是復發(fā)率高和5年生存率低[35]。由于血-腦脊液屏障的存在，目前臨床治療腦膠質瘤的有效方法幾乎局限于替莫唑胺(temozolomide，TMZ)化療和電離輻射(ionizing radiation，IR)[36]。膠質瘤細胞也可以獲得抗凋亡活性，使目前的治療方式無效。因此，靶向抗凋亡因子可能是提高膠質瘤患者生存率的好方法。研究發(fā)現(xiàn)，LOX家族蛋白質與腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Li等[37]檢測了30例配對的腦膠質瘤組織和正常組織中LOXL1基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)LOXL1在惡性膠質瘤組織中顯著高表達，并通過Wnt/β-catenin信號通路促進膠質瘤細胞U87和U251的增殖。Yu等[25]通過TCGA數(shù)據(jù)庫進行了挖掘，分析表明LOXL1基因表達水平越高，腦膠質瘤惡性程度和腫瘤進展越嚴重。通過細胞水平和動物水平的功能獲得和功能喪失實驗，研究LOXL1在促進膠質瘤細胞存活和抑制細胞凋亡中的作用。研究發(fā)現(xiàn)LOXL1通過與多種抗凋亡調節(jié)劑，特別是BAG家族分子伴侶調節(jié)因子2(BAG family molecular chaperone regulator 2，BAG2)相互作用而表現(xiàn)出抗凋亡活性。LOXL1-D515通過氫鍵與BAG2-K186相互作用，其賴氨酰氧化酶活性通過與K186泛素化競爭，阻止BAG2蛋白發(fā)生降解。此外，研究發(fā)現(xiàn)LOXL1的表達通過VEGFR/Src/CEBPA信號軸特異性上調。臨床上，血液中LOXL1水平較高的患者，腦膠質瘤組織中BAG2蛋白含量更豐富。總之，LOXL1作為一種重要的調節(jié)因子，可以增強腫瘤細胞的抗凋亡能力，靶向LOXL1的方法是治療腦膠質瘤的一種潛在策略。此外，血液中LOXL1可作為監(jiān)測膠質瘤進展的生物標志物[25]。

2.7 LOXL1與胃癌 GC是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，是全球第三大癌癥致死原因。Kasashima等[38]通過免疫組織化學研究了597例原發(fā)性胃癌的臨床病理特征與LOX家族成員(LOXL1、LOXL3和LOXL4)之間的相關性，結果顯示，LOXL1、LOXL3、LOXL4的表達與T浸潤、淋巴結轉移、淋巴及靜脈浸潤有關。LOXL1基因的表達水平與GC組織學類型和體內生長方式有關。LOXL1陽性表達的胃癌患者的總生存期顯著低于LOXL1陰性表達患者[38]。Hu等[26]研究顯示，LOXL1在胃癌組織和細胞中呈高表達，并且與胃癌患者預后差顯著相關?；蚣患治?gene set enrichment analysis，GSEA)發(fā)現(xiàn)，LOXL1基因表達與上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關的基因表達呈正相關。與一般的胃癌組織和胃癌細胞系相比，LOXL1在腹膜擴散的胃癌患者腫瘤組織和細胞系中過表達。LOXL1過表達降低E-鈣黏蛋白(cadherin 1，CDH1)表達，增加波形蛋白(vimentin，VIM)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin，CDH2)、Snail家族鋅指轉錄因子2(snail2，SNAI2)和絲束蛋白3(plastin 3，PLS3)的表達，并促進胃癌細胞的遷移。過表達LOXL1的胃癌細胞將它們的形態(tài)改變?yōu)榧忓N狀形式。此外，LOXL1 mRNA高表達與低分化的組織學類型、淋巴結轉移相關，并且是一個獨立的預后不良因素[26]。梁金娥[39]的研究表明，LOXL1基因的表達水平在不同臨床病理學特征之間存在差異，LOXL1傾向于在T分期較晚的胃癌患者中高表達。LOXL1通過WNT/β-catenin/cyclin D1通路促進胃癌細胞增殖，但LOXL1的表達并不影響胃癌細胞的侵襲和遷移。以上研究結果提示，LOXL1蛋白在胃癌中主要發(fā)揮促癌作用。然而，Chen等[40]的研究認為LOXL1基因是胃癌發(fā)生中候選的甲基化沉默的抑癌基因。愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)陽性胃癌細胞系中LOXL1的甲基化頻率顯著高于EBV陰性胃癌細胞系。胃癌中抑癌基因LOXL1的啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，說明EBV是LOXL1基因調控區(qū)甲基化的關鍵原因。結果提示EBV參與了EBV陽性胃癌的發(fā)病機制，即LOXL1基因啟動子CpG島發(fā)生異常甲基化，使抑癌基因失活[40]。

2.8 LOXL1與腎細胞癌 RCC是一種起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，為泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一。VHL綜合征(von hippel lindau，VHL)是一種常染色體顯性遺傳的遺傳性疾病，其中RCC是VHL綜合征導致的主要腫瘤類型，VHL綜合征患者在60歲時罹患RCC的風險約為70%[41]。VHL綜合征與VHL腫瘤抑制基因中的各種錯義種系突變有關。LOXL1 mRNA 在VHL基因突變的腎細胞癌細胞株中表達下調，認為LOXL1表達的缺失與RCC的發(fā)生有關，但具體的分子機制尚不清楚[27]。

2.9 LOXL1與膀胱癌 啟動子高甲基化是導致多種人類癌癥基因沉默的常見機制之一。Li等[28]通過藥理學和微陣列技術的結合在BC細胞中鑒定了59個候選高甲基化基因，發(fā)現(xiàn)LOXL1是一種候選甲基化基因，在BC細胞系中經常發(fā)生基因沉默，并且這種沉默主要與啟動子甲基化有關。在原發(fā)性膀胱腫瘤中，LOXL1和LOXL4常發(fā)生高甲基化導致表達缺失。研究表明，BC中存在LOXL4基因的體細胞突變，但沒有發(fā)現(xiàn)LOXL1基因的突變。此外，將LOXL1和LOXL4基因重新導入人類膀胱癌細胞會導致集落形成能力下降。進一步的研究表明，LOXL1和LOXL4基因的過表達可拮抗Ras激活細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路。因此，該研究表明LOXL1基因可以作為腫瘤抑制基因，通過抑制BC中的Ras/ERK信號通路發(fā)揮其功能。

3 結語與展望

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，癌癥的治療手段日趨多樣，包括手術、射頻消融、肝動脈化學栓塞術、全身化療、靶向治療和免疫治療等，患者的預后也得到改善，但目前癌癥治療仍是醫(yī)療領域的棘手問題。LOXL1基因作為一個潛在的治療靶點，在多種類型癌癥發(fā)生發(fā)展過程具有重要的作用?？赡芘c腫瘤細胞的起源、分化程度及遺傳因素有關，同時LOXL1在不同癌癥中的表達差異可能也與腫瘤間質細胞之間的相互作用和ECM的穩(wěn)定性以及LOXL1本身多樣化的生物學活性有關。然而，目前LOXL1基因抑癌或促進癌癥轉移的作用機制尚未完全明確，這些亟待解決的問題也為進一步研究LOXL1基因的作用機制拓展思路，從而尋找預防癌癥和控制癌癥轉移的新方法。