HB&L微生物培養(yǎng)系統(tǒng)用于腦脊液快速培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗的方法研究

董 蓉，張 靜，丁賠賠，張 澤，李艷君

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 檢驗科，北京 100048

顱內(nèi)感染是指病原微生物侵犯腦實質(zhì)、包膜和血管引起感染性炎癥，是顱內(nèi)術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥之一，治療難度大，致死率較高[1-2]。目前大多數(shù)實驗室病原學(xué)檢查方法是將腦脊液標(biāo)本注入血培養(yǎng)瓶中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性后再轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)過12 ～ 24 h后獲得單個菌落，再進(jìn)行后續(xù)的菌種鑒定和藥敏試驗，整個過程一般需要72 h?；诖耍瑢W(xué)者們嘗試把腦脊液陽性標(biāo)本用分離膠促凝管離心，洗滌或用試劑處理，以富集蛋白直接質(zhì)譜鑒定菌種[3-5]。但這些操作過程比較煩瑣，鑒定準(zhǔn)確率不夠理想，故尋找一種省時且準(zhǔn)確率高的檢測方法，對臨床治療十分重要。HB&L微生物培養(yǎng)系統(tǒng)(以下簡稱HB&L系統(tǒng))是意大利Alifax公司研發(fā)，于1991年在國外上市應(yīng)用，最初用于尿液病原菌快速篩查，通過在培養(yǎng)肉湯中添加營養(yǎng)物質(zhì)，輔以磁棒攪拌能夠促進(jìn)細(xì)菌的快速繁殖，采用激光散射技術(shù)實時監(jiān)測細(xì)菌生長情況，大大縮短培養(yǎng)時間。隨著技術(shù)不斷改進(jìn)，HB&L系統(tǒng)在其他方面也得到應(yīng)用，如尿液、血液、關(guān)節(jié)液、透析液等，甚至耐藥表型檢測[6-12]。本研究對腦脊液陽性標(biāo)本進(jìn)行HB&L系統(tǒng)快速培養(yǎng)，并進(jìn)行后續(xù)基于MALDITOF MS的菌種鑒定和VITEK-2 Compact的藥敏試驗，以常規(guī)法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，探討HB&L系統(tǒng)快速培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗的可行性。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 收集我中心2021年1月- 2022年1月應(yīng)用血培養(yǎng)瓶進(jìn)行腦脊液培養(yǎng)的陽性標(biāo)本(鏡檢為單一形態(tài)細(xì)菌)37例，同一患者僅納入1次。

2 主要儀器和試劑 哥倫比亞血平板、麥康凱平板、不加萬古霉素巧克力平板、需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶均購自鄭州安圖生物公司；Bact/Alert 3D全自動微生物檢測培養(yǎng)系統(tǒng)、VITEK-2 Compact全自動生化鑒定和藥敏儀器、AST-GP67、AST-N335、AST-GN09藥敏卡片、酵母樣真菌藥敏試劑盒ATB FUNGUS 3均購自法國梅里埃公司；HB&L微生物培養(yǎng)系統(tǒng)及配套體液增菌瓶均購自意大利Alifax公司；MALDI-TOF MS鑒定儀及配套基質(zhì)液購自德國布魯克公司。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212、白色假絲酵母菌ATCC6258均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

3 鏡檢 Bact/Alert 3D血培養(yǎng)儀陽性報警后，用一次性注射器抽出1 mL 腦脊液陽性培養(yǎng)液，取1 ～ 2滴涂片并行革蘭染色，鏡檢為單一形態(tài)細(xì)菌納入本研究，進(jìn)行后續(xù)試驗。

4 常規(guī)培養(yǎng)法 將腦脊液陽性培養(yǎng)液以三區(qū)劃線方式接種于哥倫比亞血平板、麥康凱平板和不加萬古霉素的巧克力平板，置于5% CO2、35℃培養(yǎng)箱中孵育18 ～ 24 h后，挑取單個純菌落，均勻涂布于質(zhì)譜儀靶板上，晾干，加1 μL 70%甲酸，晾干，加1 μL基質(zhì)液，晾干，上機(jī)進(jìn)行菌種鑒定，用VITEK-2 Compact儀器進(jìn)行藥敏試驗，并記錄鑒定和藥敏檢測的周轉(zhuǎn)時間(標(biāo)本送至檢驗科到結(jié)果回報臨床的時間間隔)。

5 HB&L快速培養(yǎng)法 用一次性無菌注射器抽出1 mL腦脊液陽性培養(yǎng)液于無菌EP管中，吸取15 μL放入ALIFAX體液增菌瓶中繼代培養(yǎng)。待儀器陽性報警后，將體液增菌瓶混勻，取1 ～ 2滴陽性增菌液涂片，革蘭染色，若鏡檢為兩種及兩種以上菌形態(tài)，則將2 ～ 3滴陽性菌液接種于哥倫比亞血平板、麥康凱平板和不加萬古霉素的巧克力平板，置于5% CO2、35℃培養(yǎng)箱中孵育18 ～ 24 h后常規(guī)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗；若鏡檢為一種菌形態(tài)，則各取1 mL于2管無菌EP管中，13 000 r/min離心5 min；棄上清，余下沉淀物中加300 μL注射用水洗滌，13 000 r/min離心5 min；棄上清，取1 μL沉淀均勻涂布于質(zhì)譜儀靶板上，晾干；加1 μL 70%甲酸；晾干，加1 μL基質(zhì)液；晾干，上機(jī)行菌種鑒定。上述沉淀物用VITEK-2 Compact儀器直接進(jìn)行藥敏試驗，并記錄鑒定和藥敏的周轉(zhuǎn)時間。

6 判讀標(biāo)準(zhǔn) 1)菌種鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：＞2.0分，鑒定到種水平；1.700 ～ 1.999分，鑒定到屬水平；＜1.7分，不可靠鑒定。2)藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)：藥敏結(jié)果的符合率和錯誤率參照ISO20776-2標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)比對結(jié)果完全滿足表1要求時，則為可接受。

表1 藥敏試驗結(jié)果符合性判斷標(biāo)準(zhǔn)Tab. 1 Criteria for judging the conformity of drug sensitivity test results

7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8軟件作圖，不符合正態(tài)分布的計量資料以Md(IQR)表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩種鑒定結(jié)果比較 37例腦脊液陽性標(biāo)本中，革蘭陽性菌16例，革蘭陰性菌19例，真菌2例。以常規(guī)結(jié)果法為參照，HB&L快速培養(yǎng)法的鑒定正確率為100%。見表2。

表2 常規(guī)法與HB&L快速培養(yǎng)法鑒定結(jié)果比較Tab. 2 Comparison of identification results between conventional culture method and HB&L rapid culture method

2 兩種培養(yǎng)法藥敏試驗結(jié)果比較 HB&L系統(tǒng)鑒定出19株革蘭陰性菌，其中1株為嗜麥芽窄食單胞菌，選擇左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和米諾環(huán)素3種抗菌藥敏紙片做藥敏試驗，結(jié)果符合率為100%。其余18株革蘭陰性菌藥敏試驗中僅有替加環(huán)素、阿米卡星、米諾環(huán)素結(jié)果符合率為94.44%(17/18)，其他抗菌藥物結(jié)果符合率均為100%。HB&L系統(tǒng)鑒定出13株革蘭陽性球菌，藥敏試驗中紅霉素結(jié)果符合率為92.31%(12/13)，其他抗菌藥物結(jié)果符合率為100%。HB&L系統(tǒng)鑒定出2株酵母樣真菌，用ATB FUNGUS 3試劑盒做藥敏試驗，兩性霉素B、伊曲康唑、氟胞嘧啶、沃爾康唑、氟康唑5種抗菌藥物結(jié)果符合率為100%。

3 HB&L法藥敏結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)率 本研究共獲得365個藥敏結(jié)果，以常規(guī)法為參照，HB&L快速培養(yǎng)法標(biāo)準(zhǔn)總符合率為98.90%(361/365)，極嚴(yán)重錯誤率為0.27%(1/365)，嚴(yán)重錯誤率為0(0/365)，一般錯誤率為0.82%(3/365)。見表3。

表3 HB&L快速培養(yǎng)法藥敏結(jié)果符合率(n, %)Tab. 3 Coincidence rate of drug sensitivity results of HB&L rapid culture method (n, %)

4 兩種鑒定和藥敏試驗周轉(zhuǎn)時間比較 37例腦脊液陽性標(biāo)本，常規(guī)法鑒定細(xì)菌的中位時間為48.42(45.71，50.47) h，HB&L快速培養(yǎng)法為26.32(23.34，32.58) h，常規(guī)法藥敏試驗的中位時間為71.55(69.70，88.64) h，HB&L快速培養(yǎng)法為46.78(40.32，56.57) h，HB&L快速培養(yǎng)法鑒定和藥敏周轉(zhuǎn)時間顯著縮短(P＜0.001)。見圖1。

圖1 常規(guī)法與HB&L快速培養(yǎng)法鑒定和藥敏周轉(zhuǎn)時間比較Fig.1 Identification and comparison of drug sensitivity turnover time between culture method and HB&L rapid culture method

討 論

隨著腦部腫瘤、外傷等開顱手術(shù)介入治療的增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染率逐漸上升，不及時治療，死亡率高達(dá)30.0%以上[13-15]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷金標(biāo)準(zhǔn)是腦脊液培養(yǎng)陽性[16]。然而常規(guī)方法的鑒定和藥敏試驗需要3 ～ 5 d，特殊菌種時間更長，期間醫(yī)生通常會經(jīng)驗性用藥，從而導(dǎo)致抗菌藥物濫用和耐藥菌株產(chǎn)生，進(jìn)一步影響臨床治療效果[17]。因此盡早提供鑒定和藥敏結(jié)果，有助于醫(yī)生快速合理選擇用藥。

HB&L系統(tǒng)是基于激光濁度法，從細(xì)菌接種到特定的肉湯培養(yǎng)，實時監(jiān)測細(xì)菌的生長曲線和定量細(xì)菌計數(shù)(CFU/mL)。HB&L系統(tǒng)是快速、全自動的增菌儀器，操作簡便、快捷、成本合適。目前，HB&L系統(tǒng)體液增菌瓶有腦脊液專用的DEB肉湯，它能保證流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌等苛養(yǎng)菌生長。Altun等[18]研究表明，該儀器8 h出陰性結(jié)果，強(qiáng)陽性標(biāo)本可在45 min報警。

本研究以傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，HB&L快速培養(yǎng)法鑒定結(jié)果正確率為100%，比Bishop等[19]將陽性標(biāo)本離心，直接用MALDITOF MS鑒定正確率(81.00%)更高，進(jìn)一步證實HB&L系統(tǒng)的優(yōu)越性。單一菌株感染時，鑒定結(jié)果全部正確，本文中剔除2例混合感染的腦脊液樣本，HB&L快速培養(yǎng)法鑒定結(jié)果僅為其中一種菌結(jié)果，可能原因是不同細(xì)菌生長特性不同，經(jīng)過短期培養(yǎng)后，存在差異，弱勢菌株生長量未達(dá)到質(zhì)譜儀檢測的最低檢出限，故檢測不出。因此，HB&L系統(tǒng)適用于單一菌種的快速培養(yǎng)，對于兩種及兩種以上菌的感染，需要與其他方法結(jié)合，使檢測結(jié)果準(zhǔn)確性更高。

從HB&L快速培養(yǎng)法藥敏試驗的符合率來看，革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和真菌藥敏試驗結(jié)果分類符合率分別為99.17%、98.72%和100%。極嚴(yán)重錯誤和一般錯誤均在可接受范圍內(nèi)。與Pan等[20]的研究結(jié)果高度一致，進(jìn)一步顯示HB&L系統(tǒng)藥敏試驗具有較高的可信度和優(yōu)越性。利用HB&L系統(tǒng)培養(yǎng)，可避免常規(guī)培養(yǎng)或藥敏試驗耗時長、報告慢、臨床經(jīng)驗性用藥等影響治療療效的問題。

從兩種方法的周轉(zhuǎn)時間來看，與常規(guī)方法比較，HB&L快速培養(yǎng)法獲得鑒定和藥敏結(jié)果的周轉(zhuǎn)時間顯著縮短。本研究中，HB&L快速培養(yǎng)法與常規(guī)法鑒定細(xì)菌的周轉(zhuǎn)時間相差22.10 h，與藥敏試驗的周轉(zhuǎn)時間相差24.77 h(P＜0.001)。HB&L快速培養(yǎng)法能提前1 d回報結(jié)果，有助于臨床早期定向治療，提高治愈率。

綜上所述，經(jīng)HB&L系統(tǒng)增菌后的菌液沉淀物，可直接用質(zhì)譜儀鑒定，亦可直接用VITEK-2 Compact儀器做藥敏試驗，具有較高的鑒定準(zhǔn)確率和藥敏符合率，且顯著縮短周轉(zhuǎn)時間，是快速細(xì)菌鑒定及藥敏試驗的新方法，有助于臨床更快速、準(zhǔn)確地獲得病原學(xué)證據(jù)，及時定向選擇抗菌藥物，提高治愈率。本研究不足之處在于僅收集到2株真菌，雖然HB&L快速培養(yǎng)法與常規(guī)法的鑒定與藥敏結(jié)果一致，周轉(zhuǎn)時間縮短24 h，但仍然需要增加株數(shù)。另外，本研究中腦脊液陽性標(biāo)本偏少，后續(xù)將擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)一步分析。