消麻散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

羅群，楊忠明，唐定洪，黃銳，李能源，任桂林，趙劍，蒲清榮

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

消麻散由羌活、黃芪、秦艽、紅花、桂枝、土鱉蟲、冰片、艾葉等15味中藥飲片組方，有溫養(yǎng)經(jīng)脈、活血通絡(luò)、消腫止痛、祛風(fēng)除痹功效。慢性骨關(guān)節(jié)炎、化學(xué)藥物治療（簡(jiǎn)稱化療）后周圍神經(jīng)病變及中風(fēng)患者均具有麻、痛、感覺遲鈍等癥狀，同屬中醫(yī)痹癥、痿證等病證，發(fā)病主要與機(jī)體的虛、瘀、寒、濕等有關(guān)。消麻散以外敷或浸泡，直達(dá)病所，疏通經(jīng)絡(luò)，加速血液循環(huán)，激發(fā)機(jī)體自身免疫功能而起效，以期寒者溫之、濕者利之、瘀者化之以通，虛者補(bǔ)之以榮，從而達(dá)到異病同治的目的，但目前消麻散缺乏行之有效的質(zhì)量控制方法。為此，本研究中對(duì)制劑桂枝（石細(xì)胞）、紅花（花粉粒）、土鱉蟲（圓形毛窩、剛毛）的特征結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微鑒別，采用薄層色譜（TLC）法對(duì)秦艽等4味中藥進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定羌活的主要藥效成分異歐前胡素含量，為建立消麻散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀、AUW120D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；CX33型顯微鏡（日本Olympus公司）；JPCT0328型超聲波提取器（武漢嘉鵬電子有限公司）；JA-SERIES型電子分析天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司，精度為千分之一）；Good-Look-1000型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆籋H-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；HGZF-II-101-3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

消麻散（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)分別為20210926，20210927，20210928，規(guī)格每袋50 g）；異歐前胡素對(duì)照品（含量99.6%）、黃芪甲苷對(duì)照品（含量96.8%）、冰片對(duì)照品（含量99.6%）、紫花前胡苷對(duì)照品（含量99.6%）、龍膽苦苷對(duì)照品（含量97.1%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110827-201812，110781-202118，111688-201602，111821-201604，110770-201918；硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司，批號(hào)分別為20210520，20200217）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；其余試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

黃芪［1］［2］315，1128：取樣品10 g，加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液100 mL，置恒溫水浴鍋，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)侄啻斡盟芙?，?0 mL，加在D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm）上，加水50 mL、40%乙醇30 mL、70%乙醇80 mL依次緩慢過柱洗脫，收集70%乙醇洗脫液，除去溶劑，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。按消麻散處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液5μL、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各5～10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置處顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 A。

羌活［3-4］：取樣品10 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，混勻，超聲（功率250 W，頻率50 kHz；下同）提取20 min，濾過，取濾液，作為供試品溶液。取紫花前胡苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。按消麻散處方和工藝制備缺羌活的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液5μL、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置處顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 B。

秦艽［5-6］：取樣品5 g，加入甲醇20 mL，混勻，超聲提取15 min，濾過，取濾液，作為供試品溶液。稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。按消麻散處方和工藝制備缺秦艽的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置處顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖1.Reference solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Astragali Radix B.Notopterygii Rhizoma et Radix C.Gentiana Macrophyllae Radix D.BorneolFig.1 TLC chromatograms

冰片［7］：取樣品6 g，加熱升華，收集升華物，加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。稱取冰片對(duì)照品適量，加乙酸乙酯溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。按消麻散處方和工藝制備缺冰片的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5～10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱顯色。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置處顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 D。

2.2 顯微鑒別

取樣品適量，挑取少量置載玻片上，加水合氯醛溶液加熱透化2～3次，滴加稀甘油，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察粉末特征結(jié)構(gòu)。桂枝，石細(xì)胞類方形或類圓形，壁厚，有的一面菲??；紅花，花粉粒呈類圓形、橢圓形，有3個(gè)萌發(fā)孔，外壁有刺；土鱉蟲，體壁碎片黃色或棕紅色，有圓形毛窩，可見長(zhǎng)短不一的剛毛。詳見圖2。表明桂枝、紅花、土鱉蟲的特征結(jié)構(gòu)明顯且唯一，檢出率高，可列入制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 顯微鑒別圖A.Cinnamomi Ramulus B.Carthami Flos C1，C2.Eupolyphaga SteleophagaFig.2 Microscopic identification images

2.3 異歐前胡素含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（58∶42，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

取異歐前胡素對(duì)照品12.25 mg，精密稱定，加甲醇制得質(zhì)量濃度為1.220 1 mg/mL的對(duì)照品貯備液，精密量取0.4 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，制得質(zhì)量濃度為48.80μg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品6 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按消麻散的處方與工藝制備缺羌活的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)按異歐前胡素峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。各成分基線分離良好，分離度＞1.5，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明專屬性良好。詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖1.IsoimperatorinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為6.10，12.20，24.40，48.80，97.61，195.22，390.43μg/mL的系列對(duì)照品溶液，吸取10μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=30 189X-111 394（R2=0.999 3）。結(jié)果表明，異歐前胡素質(zhì)量濃度在6.10～390.43μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果異歐前胡素峰面積的RSD為0.05%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果異歐前胡素峰面積的RSD為0.47%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20210926）6 g，精密稱定，共6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果異歐前胡素平均含量為385.5μg/g，RSD為0.28%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20210926）3 g，共9份，分別加入2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為1.137 4 mg/mL）0.5，1.0，1.5 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各6 g，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果異歐前胡素含量分別為385.7，384.6，384.7μg/g，平均385.0μg/g。根據(jù)《四川省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究技術(shù)指南（試行版）》，制劑中指標(biāo)性成分含量按80%設(shè)限，初步擬訂消麻散中異歐前胡素含量不得少于308μg/g，各批樣品平均含量均符合要求。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，4味藥材的TLC鑒別專屬性較強(qiáng)，陰性對(duì)照均無(wú)干擾，色譜特征斑點(diǎn)清晰，分離良好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，可用于消麻散的質(zhì)量控制。預(yù)試驗(yàn)中還參考2020年版《中國(guó)藥典（一部）》及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)組方中其余藥味進(jìn)行了TLC鑒別，結(jié)果艾葉、當(dāng)歸、桂枝、制川烏陰性樣品存在干擾，紅花供試品溶液色譜未見相同顏色主斑點(diǎn)。故5種成分的薄層鑒別暫未列入消麻散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

在制備黃芪供試品溶液時(shí)，依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（一部）》方法用4%濃氨試液的80%甲醇溶液提?。?］315，或參考文獻(xiàn)［8］依次用甲醇提取、水飽和正丁醇萃取、0.1%氫氧化鈉溶液和正丁醇飽和的水洗滌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLC斑點(diǎn)多，分離效果欠佳，在日光燈或紫外光燈（365 nm）下黃芪甲苷特征斑點(diǎn)被其他成分掩蓋，鑒別效果欠佳。在此基礎(chǔ)上，將消麻散按藥典方法得到的提取物過柱純化，結(jié)果特征斑點(diǎn)清晰，分離效果良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，故采用。冰片供試品溶液制備考察了乙醚［9］、乙酸乙酯［2］609、無(wú)水乙醇［10-11］超聲提取，供試品斑點(diǎn)多且分離度差，特征斑點(diǎn)被掩蓋，改用升華方法收集升華物進(jìn)行點(diǎn)樣，TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，方法耐用性較好，故列入消麻散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

羌活能祛風(fēng)勝濕、止痛，醫(yī)書言“太陽(yáng)經(jīng)頭痛，去諸骨節(jié)疼痛”，主治肢節(jié)疼痛，臨床可用于行痹、痛痹、寒痹等痹癥，而消麻散可用于治療慢性骨關(guān)節(jié)炎、化療后周圍神經(jīng)病變及中風(fēng)所致肢體麻木、疼痛、活動(dòng)不利等，均屬中醫(yī)“痹證”等范疇，因此兩藥功效相似?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羌活具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗氧化等活性，在治療心腦血管、神經(jīng)、消化、呼吸系統(tǒng)疾病、骨關(guān)節(jié)疾病、感染性疾病等方面有顯著療效［12］。羌活主要含有揮發(fā)油、香豆素類、糖類、氨基酸類等化學(xué)成分，其中揮發(fā)油的解熱抗炎鎮(zhèn)痛作用、香豆素類成分紫花前胡苷的鎮(zhèn)痛作用、異歐前胡素的抗炎作用較明顯［13-14］。故在選擇對(duì)紫花前胡苷進(jìn)行TLC鑒別的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)含量較高、性質(zhì)穩(wěn)定，且為藥典中羌活含量測(cè)定規(guī)定的指標(biāo)成分異歐前胡素進(jìn)行含量測(cè)定［15］。

根據(jù)文獻(xiàn)及藥典中異歐前胡素含量測(cè)定條件，在流動(dòng)相選擇方面，將分離度結(jié)果與圖譜峰的純度分析相結(jié)合，考察了乙腈-水（44∶56，V/V）［16］、乙腈-0.1%磷酸溶液（58∶42，V/V）［17］兩種流動(dòng)相，比較研究發(fā)現(xiàn)，后者相對(duì)保留時(shí)間更短，結(jié)果所得圖譜基線平穩(wěn)，峰形良好，保留時(shí)間較穩(wěn)定且適中，且色譜峰間的分離度良好。故選擇。

綜上所述，本研究中建立的消麻散中桂枝、紅花、土鱉蟲的顯微鑒別方法，黃芪、羌活、秦艽、冰片的TLC鑒別方法，以及主要有效成分異歐前胡素的含量測(cè)定方法，專屬性、重復(fù)性良好，能較全面地對(duì)消麻散進(jìn)行質(zhì)量控制。