醫(yī)學(xué)生學(xué)習(xí)透射電子顯微鏡生物制樣技術(shù)必要性研究

摘 "要 "透射電子顯微鏡是醫(yī)學(xué)院校利用率較高的大型儀器設(shè)備之一，由于設(shè)備昂貴、對(duì)制樣技術(shù)要求較高等原因，現(xiàn)主要被用于科研工作。為提高醫(yī)學(xué)生的專業(yè)素養(yǎng)和科研能力，在對(duì)外開(kāi)放實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)展透射電子顯微鏡生物制樣技術(shù)的學(xué)習(xí)，通過(guò)課堂示教、集體觀摩等方式，讓學(xué)生掌握生物制樣過(guò)程、制樣要點(diǎn)、在實(shí)際工作中的意義等，為醫(yī)學(xué)生步入臨床和科研工作打下基礎(chǔ)，也為大型儀器設(shè)備進(jìn)入醫(yī)學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供經(jīng)驗(yàn)交流。

關(guān)鍵詞 "醫(yī)學(xué)生；透射電子顯微鏡；透射電鏡生物制樣技術(shù)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

中圖分類號(hào)：G642.423 " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-489X（2022）13-0143-03

0 "引言

隨著我國(guó)高等教育的持續(xù)發(fā)展和科技水平的不斷提升，越來(lái)越多的大型精密儀器被投入高校和科研院所，其中透射電子顯微鏡在醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、化工、紡織、物理、生命科學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。透射電子顯微鏡簡(jiǎn)稱透射電鏡，是人們探究微觀世界的大型儀器之一。

1 "我國(guó)電子顯微鏡的發(fā)展

我國(guó)電子顯微鏡的研制開(kāi)始于20世紀(jì)50年代，第一臺(tái)中型透射電鏡于1958年由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所研制成功，分辨率為10 nm，加速電壓50 kV，是當(dāng)時(shí)我國(guó)的重大科技成果。1959年，大型透射電鏡研制成功，性能進(jìn)一步提高，放大倍數(shù)10萬(wàn)倍，加速電壓達(dá)到100 kV，分辨率

2.5 nm。1980年研制的DX-4透射電鏡，分辨率已達(dá)到0.3 nm，放大倍率為60萬(wàn)倍[1-2]。隨著技術(shù)水平的不斷提高，現(xiàn)在的透射電鏡分辨率已達(dá)0.1～

0.3 nm，最大放大倍率達(dá)到150萬(wàn)倍以上。目前電鏡的種類，除了常見(jiàn)的透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）外，還有超高壓電鏡（UVEM）、反射式電鏡（REM）和分析電鏡（AEM）等。電鏡迅速發(fā)展的同時(shí)，電鏡技術(shù)也得到不斷發(fā)展，在常規(guī)超薄切片技術(shù)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)冷凍復(fù)型技術(shù)、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、負(fù)染色技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)、冷凍制樣技術(shù)[3]等，由此也推動(dòng)多學(xué)科發(fā)展。

2 "透射電鏡生物制樣技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容

通過(guò)學(xué)院教務(wù)系統(tǒng)申報(bào)透射電鏡生物制樣技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的上課時(shí)間和學(xué)生數(shù)（為保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量，限制20人之內(nèi)），由學(xué)生自愿申報(bào)，學(xué)生負(fù)責(zé)人聯(lián)系教師，報(bào)告具體人數(shù)和學(xué)生名單。授課教師帶領(lǐng)學(xué)生參觀透射電鏡實(shí)驗(yàn)室，向?qū)W生介紹透射電鏡的發(fā)展現(xiàn)狀、設(shè)備構(gòu)造、工作原理、主要參數(shù)以及應(yīng)用領(lǐng)域等相關(guān)理論知識(shí)，介紹生物制樣技術(shù)在科研工作中發(fā)揮的作用以及在臨床中對(duì)疾病診斷、鑒別診斷的意義；列舉科研工作中的制樣經(jīng)驗(yàn)，引入一些經(jīng)典的透射電鏡照片，使講解更生動(dòng)。在學(xué)習(xí)生物制樣技術(shù)前，把包埋模具、銅網(wǎng)、鉆石刀、重金屬染色劑（鈾和鉛）等制樣工具和試劑介紹給學(xué)生，使學(xué)習(xí)內(nèi)容由淺入深。透射電鏡生物制樣技術(shù)包括取材、固定、梯度脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切片和染色等步驟，由于操作過(guò)程煩瑣和制樣時(shí)間所限（通常7～10天完成），制樣過(guò)程由教師分步驟示教講解操作要點(diǎn)。制作透射電鏡超薄切片需要注意以下幾點(diǎn)。

1）取材遵循五字原則，即快、小、冷、凈、準(zhǔn)?？欤航M織離體后盡快進(jìn)入固定液，避免細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜破裂，組織自溶。小：2.5%戊二醛固定液滲透速率較慢（僅為0.5 mm/h）[4]，為使固定液迅速浸入細(xì)胞和組織間隙，組織標(biāo)本的取材大小應(yīng)為

1 mm3。冷：取材過(guò)程在冰盒上進(jìn)行，冷的環(huán)境可以降低各種酶的活性，使超微結(jié)構(gòu)保持原有狀態(tài)。凈：用緩沖液沖洗組織標(biāo)本表面，避免殘留血液、黏液等，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。準(zhǔn)：取材的位置要求定位和定向準(zhǔn)確，避免重切重染增加工作量，對(duì)于珍貴的組織標(biāo)本，無(wú)法重現(xiàn)相同結(jié)構(gòu)，將造成重大損失。注意某些組織具有方向性，比如腸道、皮膚、氣管、血管、神經(jīng)、眼組織等，取材時(shí)注意區(qū)分。

2）特殊組織固定需要注意：腦對(duì)缺氧較敏感，需要先灌流固定再取材；管狀組織取0.5 cm左右長(zhǎng)軸方向固定；肺組織密度小，用紗布包裹后放入固定液即可下沉；視網(wǎng)膜易脫離、皺褶，應(yīng)先灌流固定，再剪開(kāi)角膜注入固定液[5]；睪丸白膜下面是精曲小管，常規(guī)取材易散開(kāi)，應(yīng)在白膜上面劃若干小口，固定一段時(shí)間后再取材；細(xì)菌和細(xì)胞取材3×106～5×106即可，吸管吹散使充分接觸固定液，自然沉降切勿離心。

3）前固定是2.5%戊二醛，固定時(shí)間至少四小時(shí)；經(jīng)過(guò)充分浸洗，浸入后固定液1%鋨酸中，后固定時(shí)間因不同組織而異，一般不超過(guò)兩小時(shí)。

4）梯度脫水時(shí)間要充分，組織在包埋劑中浸透最好過(guò)夜。

5）獲得連續(xù)切片的關(guān)鍵之一是修塊，使包埋塊切面成正方形、長(zhǎng)方形或者梯形，且邊角銳利。

6）超薄切片厚度60～90 nm為宜，此厚度在切片機(jī)鏡下呈銀鏡樣反射。鉆石刀價(jià)格昂貴，應(yīng)在熟練操作玻璃刀的基礎(chǔ)上謹(jǐn)慎對(duì)刀，防止碰撞。

7）染色是重點(diǎn)環(huán)節(jié)，鈾染液需靜置取上清，鉛染液要過(guò)濾，整個(gè)染色過(guò)程要避光，減少暴露空氣的機(jī)會(huì)，避免出現(xiàn)染色液污染。組織超薄切片制作完成，由指導(dǎo)教師開(kāi)機(jī)上樣，學(xué)生實(shí)地觀摩學(xué)習(xí)，結(jié)合透射電鏡下組織超微結(jié)構(gòu)圖像，教師邊講解邊提問(wèn)，既學(xué)習(xí)新知識(shí)，又回顧書(shū)本上的內(nèi)容，引導(dǎo)學(xué)生不斷探索生命的奧秘。

3 "醫(yī)學(xué)生學(xué)習(xí)透射電鏡生物制樣技術(shù)的必

要性

3.1 "學(xué)習(xí)透射電鏡生物制樣技術(shù)課的思路

透射電鏡為大型精密儀器，價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，導(dǎo)致多數(shù)高校只將其用于科研工作，極少在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中面向?qū)W生開(kāi)放，學(xué)生對(duì)其知之甚少，或者只在書(shū)本上有大概了解，沒(méi)有實(shí)踐學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)。為使其能在高?？蒲泻徒虒W(xué)中發(fā)揮作用，體現(xiàn)價(jià)值[6]，學(xué)校建立對(duì)外開(kāi)放實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)。學(xué)生通過(guò)書(shū)本上透射電鏡生物制樣技術(shù)的文字和圖片介紹，在頭腦中形成的是抽象的概念，對(duì)內(nèi)容的理解也是膚淺的，對(duì)生物制樣的過(guò)程沒(méi)有直觀感受，導(dǎo)致學(xué)習(xí)的興趣和積極性不高。開(kāi)設(shè)透射電鏡生物制樣技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，可以通過(guò)教師現(xiàn)場(chǎng)講授和學(xué)生觀摩學(xué)習(xí)的方式，拉近學(xué)生與設(shè)備的距離，也拉近理論與臨床實(shí)踐的距離，使科教臨相互滲透，讓學(xué)生對(duì)透射電鏡制樣技術(shù)的方法、應(yīng)用和意義等有比較全面的掌握，加深印象，牢記所學(xué)知識(shí)點(diǎn)。

目前，多數(shù)高校在透射電鏡授課方面對(duì)設(shè)備工作原理、構(gòu)造與操作等講授比較多，對(duì)制樣技術(shù)沒(méi)有提及或涉及較少。由于透射電鏡是形態(tài)學(xué)研究的精密儀器之一，對(duì)于醫(yī)學(xué)生來(lái)說(shuō)，組織結(jié)構(gòu)的觀察辨識(shí)是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課，學(xué)習(xí)生物制樣技術(shù)可讓他們看到光鏡下所看不到的結(jié)構(gòu)，極大地拓寬視野[7]和專業(yè)知識(shí)，幫助其掌握制樣過(guò)程的細(xì)節(jié)和注意事項(xiàng)，不僅知其然，而且知其所以然。對(duì)樣品超微結(jié)構(gòu)的觀察和研究，不僅要有分辨率精準(zhǔn)的設(shè)備，更要有制備樣品所用的各種技術(shù)方法，兩者相輔相成，缺一不可，為此開(kāi)設(shè)透射電鏡生物制樣技術(shù)課程。

3.2 "學(xué)習(xí)透射電鏡生物制樣技術(shù)的意義

通過(guò)學(xué)習(xí)透射電鏡生物制樣技術(shù)，學(xué)生不僅可以掌握超薄切片的制備方法，而且可以學(xué)習(xí)如何從這些超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)組織病理的改變，進(jìn)而對(duì)疾病的鑒別診斷給出正確結(jié)論，從而不斷提升專業(yè)修養(yǎng)，增強(qiáng)為患者服務(wù)的本領(lǐng)。學(xué)生可以在計(jì)算機(jī)上看到組織超微結(jié)構(gòu)圖像，從觀察細(xì)胞器開(kāi)始，培養(yǎng)探索生命和疾病本質(zhì)的興趣，激發(fā)從醫(yī)的信心和立志為患者解除病痛的決心。

學(xué)習(xí)透射電鏡生物制樣技術(shù)可以強(qiáng)化課堂理論學(xué)習(xí)，同時(shí)使各個(gè)相關(guān)學(xué)科知識(shí)點(diǎn)融會(huì)貫通，提高學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，培養(yǎng)其學(xué)習(xí)熱情。在實(shí)際工作中，大部分科研人員和臨床醫(yī)生不能親自完成生物制樣，通常由專業(yè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員完成。醫(yī)生的職業(yè)特點(diǎn)要求他們終身學(xué)習(xí)，掌握全面的醫(yī)學(xué)相關(guān)知識(shí)。因此，醫(yī)學(xué)生開(kāi)展透射電鏡生物制樣技術(shù)的學(xué)習(xí)，既可以啟發(fā)興趣、拓展知識(shí)面，激發(fā)主動(dòng)學(xué)習(xí)的意識(shí)，增強(qiáng)救死扶傷的本領(lǐng)，也有助于養(yǎng)成良好的科學(xué)研究思維和素養(yǎng)。

透射電鏡生物制樣過(guò)程中的每一步驟都需要細(xì)致入微，認(rèn)真對(duì)待，任何的失誤都會(huì)造成制樣失敗。因此，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)注意啟發(fā)學(xué)生熱愛(ài)醫(yī)學(xué)、尊重生命，積極探索微觀世界，樹(shù)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲凶黠L(fēng)和醫(yī)者的責(zé)任感。

醫(yī)學(xué)生在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)習(xí)階段應(yīng)多學(xué)習(xí)與臨床和科研相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握臨床病理診斷和科研工作的前沿技術(shù)方法，為將來(lái)進(jìn)入工作崗位打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。透射電鏡超薄切片也是臨床某些疾病病理診斷的黃金指標(biāo)，醫(yī)學(xué)生能從形態(tài)學(xué)角度分析病情，是加強(qiáng)專業(yè)學(xué)習(xí)的關(guān)鍵。

深入學(xué)習(xí)透射電鏡生物制樣技術(shù)是醫(yī)學(xué)生增強(qiáng)本領(lǐng)的需要，是理論與實(shí)踐相結(jié)合的需要，是拓展專業(yè)知識(shí)的需要，更是提高臨床技能和科研實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ男枰?。要培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生的動(dòng)手能力、思考能力，提高實(shí)驗(yàn)操作技能，啟發(fā)探索微觀世界的興趣，同時(shí)引導(dǎo)他們無(wú)論將來(lái)從事臨床工作還是科研工作，務(wù)必求真，務(wù)必尊重科學(xué)。透射電鏡技術(shù)的進(jìn)步大大加深人類對(duì)生命科學(xué)的認(rèn)識(shí)，從宏觀世界到微觀世界，從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平，從分子水平再到原子水平，透射電鏡在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了革命性的作用。讓透射電鏡生物制樣技術(shù)走進(jìn)醫(yī)學(xué)院校課堂是時(shí)代所需[8]，是醫(yī)學(xué)生扎實(shí)學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的需要，是他們提高專業(yè)本領(lǐng)的要求，而掌握透射電鏡生物制樣技術(shù)是醫(yī)者的使命擔(dān)當(dāng)，更是他們的職業(yè)所必須。

3.3 "透射電鏡生物制樣技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

透射電鏡生物制樣技術(shù)在臨床各種疾病的早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)測(cè)過(guò)程中具有重要意義。遺傳性疾病和代謝異常導(dǎo)致的疾病，其光鏡切片并不能在早期觀察到細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的改變。如先天的肝臟代謝異常，應(yīng)用透射電鏡觀察線粒體在早期的病理變化對(duì)診斷有很高價(jià)值。有些腎病，比如免疫復(fù)合物性腎炎、膜性腎炎等，光鏡下無(wú)明顯結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光有時(shí)定位不準(zhǔn)或抗體效價(jià)降低，只能通過(guò)透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)中上皮細(xì)胞、系膜、肌膜細(xì)胞和間質(zhì)改變，明確腎小球內(nèi)電子致密沉積物的精確定位等來(lái)確診[9]。各種早期腫瘤篩查，通過(guò)尋找組織細(xì)胞的分化標(biāo)記，確診和鑒別腫瘤類型。如急性髓系白血病的診斷分型，通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞核和線粒體的結(jié)構(gòu)、形態(tài)變化，可以提高鑒別能力，分型效果具有明顯優(yōu)勢(shì)[10]。病毒性疾病的鑒別診斷，常用透射電鏡負(fù)染技術(shù)，負(fù)染色的特點(diǎn)是反差強(qiáng)，可以看到病毒亞單位結(jié)構(gòu)、細(xì)菌和支原體的超微結(jié)構(gòu)等，它也是病毒性致病因子的快速診斷方法之一[11]，能夠發(fā)現(xiàn)和識(shí)別病毒，為病毒的分類、病毒復(fù)制過(guò)程、病毒與宿主之間的關(guān)系等提供直觀圖像依據(jù)。

透射電鏡技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合形成免疫電鏡技術(shù)，通過(guò)標(biāo)記物可以精確定位和檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的抗原、抗體。有些腎病單靠透射電鏡不能確診，比如lg A腎病合并膜性腎炎，用膠體金標(biāo)記特異性抗體lg A和lg G，通過(guò)觀察腎小球上皮下和系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積分布情況和電子致密物的成分，確定腎病的分型[12]。

透射電鏡生物制樣技術(shù)的不斷發(fā)展，使其被廣泛應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的各個(gè)方面，為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供更多的研究手段，為疾病診斷提供可靠依據(jù)。

4 "結(jié)束語(yǔ)

醫(yī)學(xué)生通過(guò)透射電鏡生物制樣技術(shù)的學(xué)習(xí)，認(rèn)識(shí)到制樣技術(shù)的重要性：在臨床上是發(fā)現(xiàn)和診斷某些疾病的重要手段，在科研中是認(rèn)識(shí)物質(zhì)世界的重要工具，是發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的基本方法。制樣技術(shù)是動(dòng)手性極強(qiáng)的形態(tài)學(xué)研究手段，能開(kāi)闊學(xué)生專業(yè)知識(shí)視野，同時(shí)幫助學(xué)生養(yǎng)成認(rèn)真細(xì)致和尊重客觀事實(shí)的工作態(tài)度。由于受制樣時(shí)間、課時(shí)和所用試劑稀缺等因素影響，目前透射電鏡生物制樣技術(shù)課程內(nèi)容還不能完全在臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)專業(yè)開(kāi)設(shè)，學(xué)生無(wú)法親自完成制樣。隨著計(jì)算機(jī)的發(fā)展，期待未來(lái)可以有透射電鏡生物制樣技術(shù)的虛擬仿真系統(tǒng)，使生物制樣過(guò)程變得生動(dòng)形象，同時(shí)能對(duì)學(xué)生制樣的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)和打分，徹底解決生物制樣實(shí)驗(yàn)教學(xué)中學(xué)生只看不做的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)

[1] 付洪蘭.實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)[M].北京：高等教育出

版社，2004：2-3.

[2] 謝書(shū)堪.中國(guó)透射式電子顯微鏡發(fā)展的歷程[J].物

理，2012，41（6）：401-406.

[3] 孫玉，周利華.電子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用：評(píng)

《電子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用》[J].電子顯微

學(xué)報(bào)，2020，39（2）：232-233.

[4] 黃靜，彭彬.常規(guī)透射電鏡生物樣品制樣條件的摸索

總結(jié)[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2021，36（1）：119-121.

[5] 周晨明，朱艷，孟麗，等.透射電鏡樣品取材和固定

應(yīng)注意的若干問(wèn)題[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2020，33（14）：

2416，2412.

[6] 魏居孟，宋常春.透射電子顯微鏡在《材料科學(xué)基礎(chǔ)》

課程教學(xué)中的作用[J].廣州化工，2018，46（19）：122-

124，127.

[7] 李紅梅，李茵茵，李曉筠，等.電子顯微鏡在本科實(shí)

驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2021，24（2）：156-

158.

[8] 孫計(jì)桃.電子顯微鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].

內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)，2012（2）：127-128.

[9] 黃朝興，呂吟秋，方周溪，等.透射電鏡檢查在腎小

球疾病病理診斷中的作用[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，

32（1）：10-12.

[10] 黃樹(shù)旭，趙軾軒，劉津華，等.透射電鏡在急性髓

系白血病診斷中的作用[J].中華血液學(xué)雜志，

2013（3）：205-207.

[11] 王霖，邱嫻，鄭金桔.透射電鏡在應(yīng)用型本科實(shí)驗(yàn)教

學(xué)中的應(yīng)用探索[J].寧波工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，

32（4）：126-130.

[12] 石佼玉，張志剛.免疫膠體金電鏡技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究

中的應(yīng)用[J].臨床與病理雜志，2019，39（9）：2079-

2085.