散發(fā)性先天性心臟病相關(guān)SMAD1基因新突變研究

陳春英 劉興元 楊奕清

先天性心臟病是人類最常見的出生畸形，在活產(chǎn)新生兒中的發(fā)病率約為1%，可導(dǎo)致肺動脈高壓、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延遲、腦損傷、心力衰竭、感染性心內(nèi)膜炎以及致命性室性心律失常等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至可致心源性猝死[1-2]。遺傳學(xué)研究表明先天性心臟病主要是由遺傳異常所致，除染色體異常和拷貝數(shù)變異外，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100 多個先天性心臟病致病基因，包括可導(dǎo)致家族性先天性心臟病的心臟轉(zhuǎn)錄因子基因SMAD1[3]。由于先天性心臟病具有顯著的遺傳異質(zhì)性，且大多數(shù)先天性心臟病為散發(fā)[4-5]，因此，有必要進一步研究SMAD1基因與散發(fā)性先天性心臟病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016 年3 月至2021 年10 月，入選202 例漢族散發(fā)性患兒為病例組，其中男性115 例，女性87 例，年齡為1～13 歲，平均年齡為（5±4）歲。對照組為238 名漢族健康志愿者，其中男性136 名，女性102 名，年齡為1～13 歲，平均年齡為（5±3）歲。所有研究對象均經(jīng)過詳細臨床分析，包括家族史及病史回顧、體格檢查和多普勒彩色心臟超聲檢查。根據(jù)陰性家族史、陽性心臟超聲檢查結(jié)果或心臟手術(shù)記錄，診斷散發(fā)性先天性心臟病[6]。病例組和對照組均無先天性心臟病家族史，也均無可誘發(fā)先天性心臟病的環(huán)境危險因素。本研究遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)范，并獲得同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。經(jīng)研究對象知情同意后，收集其臨床資料和全血標(biāo)本，用基因組DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司）常規(guī)純化基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1SMAD1基因的擴增 通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增SMAD1基因全部編碼外顯子、剪接位點以及部分5'和3'端非翻譯區(qū)，引物DNA 序列見參考文獻[3]。以每一研究對象的基因組DNA為模板，應(yīng)用合成的上述特異性SMAD1擴增引物及熱啟動 DNA 聚合酶試劑盒(德國Qiagen 公司)，在PCR 儀(美國Bio-Rad 公司)上對SMAD1基因片段進行擴增。PCR 混合物的總體積為50 μL，包括5×Q 溶液10 μL、雙蒸水26.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、上下游引物（20 μmol/L）各1 μL、10×PCR 緩沖液5 μL、基因組DNA（50 ng/μL）2 μL 和熱啟動DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL。PCR 的條件設(shè)置見參考文獻[7]：95 ℃預(yù)變性15 min，隨即進入38 個熱循環(huán)，每個熱循環(huán)包括94 ℃變性30 s、62℃ 退火30 s 和72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后割膠回收并用凝膠DNA 提取試劑盒（美國Bio-Tek 公司）進行純化。

1.2.2SMAD1基因的Sanger 測序分析 以上述純化的PCR 產(chǎn)物作為模板，使用1 條SMAD1基因擴增引物及DNA 循環(huán)測序試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公 司）在PCR 儀(美 國Bio-Rad公司)上進行Sanger 測序反應(yīng)。測序反應(yīng)混合物的體積為20 μL，其中SMAD1基因DNA 片段（30 ng/μL）2 μL、預(yù)混合液8 μL、正向引物（2 μmol/L）2 μL、雙蒸水8 μL。測序反應(yīng)的條件[7]：30 個循環(huán)，每個熱循環(huán)包括95 ℃變性20 s、50 ℃ 退火15 s 和60 ℃延伸l min。測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化回收后在DNA 分析儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)上進行DNA 測序。將所測出的SMAD1基因序列與核苷酸數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide）中 的SMAD1基因序列(登陸號：NM_005900.3)進行比較分析，以發(fā)現(xiàn)SMAD1基因突變。如果識別出SMAD1基因突變，就測序分析238 名健康對照者的SMAD1基因，同時檢索HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）、PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed）和萬方數(shù)據(jù)庫(https://g.wanfangdata.com.cn/index.html），以核實所發(fā)現(xiàn)的SMAD1基因突變是否是新突變。

1.2.3SMAD1基因突變的致病性模擬分析 通過在線計算機軟件MutationTaster（http://www.mutationtaster.org/）預(yù)測分析SMAD1基因突變是否具有致病性。

1.2.4SMAD1基因突變體的功能研究 野生型SMAD1的表達載體SMAD1-pcDNA3.1 及其靶基因TBX20啟動子驅(qū)動螢火蟲熒光素酶（luc）表達的報告基因表達載體TBX20-luc 的構(gòu)建可見參考文獻[3]。以野生型SMAD1-pcDNA3.1 為模板，應(yīng)用1 對長31 個堿基的互補引物（以突變點為中心）和定點誘變試劑盒（美國Stratagene 公司），通過PCR 獲得突變型SMAD1-pcDNA3.1。應(yīng)用DNA 酶Dpn I（美國NEB 公司）切除野生型SMAD1-pcDNA3.1模板并經(jīng)過DNA 測序證實獲得序列正確的突變型SMAD1-pcDNA3.1。COS7 細胞培養(yǎng)及多種表達載體共轉(zhuǎn)染的方法見參考文獻[3]。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h收集、裂解COS7 細胞。用雙報告基因（螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達基因）分析試劑盒（美國Promega 公司）在熒光分析儀（美國Promega公司）上定量分析細胞裂解液中熒光素酶的活性。以2 種熒光素酶的活性之比（螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性）表示靶基因TBX20啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[3]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 組連續(xù)變量如入選研究對象的年齡、靶基因TBX20啟動子的轉(zhuǎn)錄活性等的比較用非配對Student'st檢驗；分類變量如入選研究對象的種族、性別等的比較用Pearson'sχ2檢驗或Fisher's 精確概率檢驗。以雙側(cè)檢驗概率值P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒別出SMAD1基因新突變

本研究病例組（n＝202）與對照組（n＝238）入選者均為中國大陸漢族人，均無先天性心臟病家族史，兩組間性別無統(tǒng)計學(xué)差異（經(jīng)Pearson’sχ2檢驗P＞0.05）和年齡（經(jīng)Student’st檢驗P＞0.05）也沒有統(tǒng)計學(xué)差異。通過對202 例散發(fā)性先天性心臟病患兒的SMAD1基因進行Sanger 測序分析，在其中1 例3 歲的男性先天性右心室雙流出道合并室間隔缺損患兒檢測出1 種SMAD1基因雜合無義突變，即NM_005900.3: c.381T＞A；p.(Cys127*)突變。該SMAD1基因突變不存在于238 名健康兒童，在HGMD、SNP、PubMed 和萬方數(shù)據(jù)庫也均無報道，表明該SMAD1基因突變是1 個新突變。該例先天性右心室雙流出道合并室間隔缺損患兒的SMAD1基因c.381T＞A 雜合突變及其純合野生型對照DNA 序列見圖1。

圖1 SMAD1 基因的c.381T＞A突變（雜合子）及其野生型（純合子）對照DNA序列

2.2 SMAD1基因新突變c.381T＞A有致病性

SMAD1基因新突變c.381T＞A 被在線軟件MutationTaster 預(yù)測為有致病性，這種預(yù)測的正確率約為1（＞0.9999）。

2.3 Cys127*-突變型SMAD1對靶基因TBX20的轉(zhuǎn)錄激活功能喪失

在轉(zhuǎn)染了多種基因表達載體的COS7 細胞，400 ng 的野生型SMAD1-pcDNA3.1 和等量（400 ng）的Cys127*-突 變 型SMAD1對靶基因TBX20啟動子的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)分別約為11 倍（10.9328± 1.63）和1倍（1.14±0.41），2 組 之 間具有顯著性差異（t＝10.02,P＝0.0006）；而在同時轉(zhuǎn)染了200 ng 的野生型SMAD1-pcDNA3.1 和等量（200 ng）的Cys127*-突 變 型SMAD1時，所 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)約為6 倍（5.80±0.71），顯著低于400 ng 的野生型SMAD1-pcDNA3.1 所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用，2 組之間具有顯著性差異（t＝4.96，P＝0.007）。

3 討論

本研究在1 例散發(fā)性先天性心臟?。ㄓ倚氖译p流出道合并室間隔缺損）患兒中發(fā)現(xiàn)了1 種新的SMAD1基因雜合無義突變，即NM_005900.3: c.381T＞A;p.(Cys127*) 突變。該SMAD1基 因 突變不存在于238 名健康兒童，在HGMD、SNP、PubMed 和萬方數(shù)據(jù)庫也均無報道。在線計算機軟件MutationTaster 模擬分析結(jié)果提示該突變具有致病性。報告基因分析表明Cys127*-突變型SMAD1對靶基因TBX20啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用喪失，而TBX20功能障礙已經(jīng)被證實可導(dǎo)致先天性心臟病[3]。因此，SMAD1基因新突變c.381T＞A 或 p.(Cys127*) 很可能是該例散發(fā)性先天性心臟?。ㄓ倚氖译p流出道合并室間隔缺損）患兒的分子病因。

人類SMAD1基因定位于4 號染色體4q31.21，編碼一種屬于SMAD 超家族的轉(zhuǎn)錄因子，由465 個 氨基酸殘基組成[3]。SMAD1在整個胚胎發(fā)育期大量表達于心血管系統(tǒng)，可單獨或與TBX20或MYOCD協(xié)同轉(zhuǎn)錄激活對心臟形態(tài)發(fā)育具有關(guān)鍵作用的靶基因（如TBX20、NKX2-5、TCTC1和MYH6）[8-10]。不僅如此，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TBX20、NKX2-5、TCTC1、MYH6和MYOCD基因功能缺失性突變均可導(dǎo)致先天性心臟病[11-15]。本研究發(fā)現(xiàn)SMAD1基因功能缺失性新突變可導(dǎo)致右心室雙流出道合并室間隔缺損。這些研究結(jié)果顯示SMAD1基因單倍型不足是人類先天性心臟病的分子機制之一。

既往的實驗動物研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育期間，SMAD1可以在多種動物（包括小鼠、大鼠、蟾蜍和斑馬魚）的心血管系統(tǒng)大量表達，通過調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、凋亡，在心血管形態(tài)發(fā)育方面發(fā)揮重要作用[16-17]。在模型小鼠，Smad1基因敲除可導(dǎo)致胚胎死亡，主要原因在于胚胎不能著床于胎盤，胚胎中原始生殖細胞生成障礙及數(shù)量顯著減少；而Smad1基因敲除雜合子小鼠發(fā)育無明顯異常，這很可能與屬于同一基因族的Smad5和Smad8基因的代償作用有關(guān)，因為Smad5和Smad8基因的表達部位和蛋白功能特點與Smad1的相似[18-19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，盡管Smad1基因或Smad5基因單獨敲除的雜合子小鼠發(fā)育正常，但Smad1基因和Smad5基因聯(lián)合敲除的雜合子小鼠在胚胎期死亡，主要是因為小鼠胚胎心臟環(huán)化和偏側(cè)化障礙[19]。此外，內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞特異性敲除Smad1基因小鼠可發(fā)生肺動脈高壓、右心室肥厚和肺小動脈壁厚度增加[20]。這些實驗動物研究結(jié)果支持SMAD1基因功能缺失性突變導(dǎo)致人類先天性心 臟病。

值得注意的是，SMAD1基因功能缺失性突變此前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致家族性動脈導(dǎo)管未閉、室間隔缺損和肺動脈狹窄[3]。本研究識別出SMAD1基因功能缺失性新突變可導(dǎo)致散發(fā)性右心室雙流出道合并室間隔缺損，從而擴大了先天性心臟病相關(guān)SMAD1基因突變譜。

總之，本研究識別出了1 種新的SMAD1基因功能缺失性突變可導(dǎo)致右心室雙流出道和室間隔缺損，這對先天性心臟病的早期精準(zhǔn)預(yù)防有潛在的臨床意義。