Bmal1過表達(dá)對動脈粥樣硬化斑塊病變程度及穩(wěn)定性的影響

朱勝奎 丁家望 汪心安 張再強 萬劍橋

動脈粥樣硬化是大、中型動脈的慢性非特異性炎性病變，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┳畛Ｒ姷牟±砘A(chǔ)[1]。動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律相關(guān)基因參與了動脈粥樣硬化的形成過程，晝夜節(jié)律紊亂會引起動脈粥樣硬化的病理紊亂，促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[2-3]。生物鐘基因是生物晝夜節(jié)律呈現(xiàn)的分子基礎(chǔ)，哺乳動物的生物鐘主要位于下丘腦視交叉上核（SCN）。腦肌類芳烴受體核轉(zhuǎn)位樣蛋白1 基因（Bmal1）在晝夜節(jié)律系統(tǒng)中至關(guān)重要，是唯一單獨缺失即可導(dǎo)致全身節(jié)律喪失的核心時鐘基因[4-5]，可影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程[6-7]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可局灶性破壞細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致粥樣斑塊不穩(wěn)定[8]。本研究建立小鼠動脈粥樣硬化模型，探討B(tài)mal1 對動脈粥樣硬化病變程度及斑塊穩(wěn)定性的影響，為動脈粥樣硬化的防治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級ApoE-/-雄性、雌性種鼠各3 只，血管平滑肌細(xì)胞特異性Bmal1轉(zhuǎn)基因的SM-Bmal1-TG/ApoE-/-雄性、雌性小鼠各3 只，均購自武漢大學(xué)動物實驗中心并分籠喂養(yǎng)于三峽大學(xué)實驗動物中心，繁殖后選取符合實驗要求的小鼠，生產(chǎn)許可證號為SCXK（鄂）2016-0006。所有實驗小鼠11周齡，體質(zhì)量為15～20 g。動物飼養(yǎng)間溫度（22±2）°C，濕度（60±5）%，保持明暗交替的光照條件，均予以高脂飲食（蛋白質(zhì)15.8%、脂肪40%、碳水化合物44.2%），實驗經(jīng)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)，實驗動物設(shè)施使用證明許可證號為SYXK（鄂）2017-0061。實驗小鼠分為2 組，ApoE-/-組（雄性小鼠，n＝12)、SM-Bmal1-TG/ApoE-/-組（雄性小鼠，n＝12)。

1.2 動物模型構(gòu)建

取出生1 周后的小鼠腳趾或尾部組織，運用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行Bmal1轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定。小鼠11 周齡時，分離ApoE-/-小鼠、SM-Bmal1-TG/ApoE-/-小鼠左側(cè)頸總動脈血管，血管外置入外徑0.5 mm、內(nèi)徑0.3 mm、長度為10 mm 的CAST 套管，造成局部血管狹窄，以利于形成湍流，促進(jìn)動脈粥樣硬化形成，小鼠造模前高脂喂養(yǎng)2 周，造模后繼續(xù)高脂喂養(yǎng) 9 周。

1.3 血脂水平檢測

各組小鼠通過眶靜脈采血，按照試劑盒說明書檢測三酰甘油（TC）、總膽固醇（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.4 蘇木精-伊紅染色

處死小鼠后分離小鼠行CAST 套管手術(shù)的頸總動脈，清除血管外組織，置于4%多聚甲醛緩沖液中固定，蘇木精-伊紅（HE）染色。鏡下觀察病理切片形態(tài)，每只動物取5 張切片，計算斑塊面積平均值。

1.5 Western blot法檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平

采用RIPA 裂解液提取小鼠頸總動脈組織總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后，TBST 室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育30 min，進(jìn)行Western Blot 檢測。掃描條帶并計算目的蛋白的相對表達(dá)水平，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，本實驗所用試劑盒購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠血脂水平比較

與 ApoE-/-組比較，SM-Bmal1-TG/ApoE-/-組TG、TC、LDL-C 均顯著降低（P均＜0.05），2 組HDL-C 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表 1。

表1 2組小鼠血脂水平比較（n＝12）

2.2 2組小鼠斑塊病理學(xué)檢測結(jié)果比較

HE 染色可見 ApoE-/-組小鼠頸動脈血管內(nèi)皮下有脂質(zhì)沉積，動脈粥樣硬化斑塊形成，血管內(nèi)膜增厚，并突向管腔，管腔中央有血栓形 成；SM-Bmal1-TG/ApoE-/-組小鼠頸動脈血管內(nèi)皮下有少量脂質(zhì)沉積，動脈粥樣硬化斑塊明顯減少，血管內(nèi)膜部分增厚，管腔中央可見少量血栓形成。與ApoE-/-組小鼠相比，SM-Bmal1-TG/ApoE-/-組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積減少25%[（14.62±0.79）%對（20.62±6.00）%，P＜0.05]，見圖 1。

圖1 2組小鼠頸總動脈HE 染色情況

2.3 2組小鼠MMP-2、MMP-9表達(dá)水平比較

與ApoE-/-組相比，SM-Bmal1-TG/ApoE-/-組MMP-2、MMP-9 的蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 2組小鼠MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況

3 討論

動脈粥樣硬化是長期的慢性炎性反應(yīng)病變過程，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞共同參與斑塊形成[9]。既往研究報道，Bmal1 在血管損傷后作為血管平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)因子，可抑制血管內(nèi)膜增厚程度，提示Bmal1 是治療動脈粥樣硬化的新靶點[10]。敲除全身及肝細(xì)胞特異性Bmal1，可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠高脂血癥并增強動脈粥樣硬化程度，而過表達(dá)Bmal1后則可改善高脂血癥及動脈粥樣硬化程度[11]。本研究旨在探討晝夜節(jié)律基因Bmal1與動脈粥樣硬化斑塊病變程度及穩(wěn)定性的相關(guān)性。MMP-2、MMP-9 屬于MMP家族成員，與斑塊不穩(wěn)定有密切關(guān)系。在不穩(wěn)定斑塊區(qū)域，MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平較高，酶活性明顯增強，易引起不穩(wěn)定斑塊發(fā)生破裂。MMP-2 和MMP-9 是血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移所必需的，在纖維帽的發(fā)育和維持中起重要作用，尤其是在晚期斑塊中，MMP-2、MMP-9 水平明顯增加，與巨噬細(xì)胞聚集有關(guān)，其可能通過促進(jìn)斑塊內(nèi)出血導(dǎo)致斑塊破裂[8,12]。研究顯示，在Bmal1-/-小鼠的動脈中，MMP-2 和MMP-9 表達(dá)水平均增加[13]。Bmal1過表達(dá)可維持斑塊的穩(wěn)定性。

本研究顯示，SM-Bmal1-TG/ApoE-/-、ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)后，Bmal1過表達(dá)小鼠的頸動脈斑塊病變面積明顯減少，且斑塊內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平下降。因此，Bmal1 在一定程度上可抑制動脈粥樣硬化斑塊的病變程度并有利于維持斑塊的穩(wěn)定性，具有抗動脈粥樣硬化的作用。隨著對動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，Bmal1可能成為抗動脈粥樣硬化的新靶點。