心肌梗死對比格犬左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)時鐘基因表達的影響

劉旨浩 王宇虹 王鈞 周慧鑫 于中洋 張嵩 矯鸝瑩 聶鸝慶 王悅怡 江洪 余鋰鐳

生物鐘幾乎存在于哺乳動物的所有細胞中，通過一系列復雜的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路（TTFL）實現(xiàn)組織和器官功能上的晝夜波動[1]。這些TTFL 主要由核心時鐘基因（Bmal1、Clock、Per1、Per2、Cry1和Cry2等）和鐘控基因（Nr1d1、Nr1d2、Rorα和Tim等）相互作用形成，共同調(diào)節(jié)機體行為的晝夜節(jié)律[1]。研究表明，心肌梗死后猝死事件的發(fā)生具有明顯的晝夜分布，其潛在機制尚不清 楚[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)（LSG）是心臟交感神經(jīng)過度激活并觸發(fā)心肌梗死后猝死事件的關鍵環(huán)節(jié)[4]。本研究旨在探究心肌梗死對比格犬LSG 時鐘基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

12 只健康成年雄性比格犬由武漢大學人民醫(yī)院動物中心提供，體質(zhì)量為18～22 kg，飼養(yǎng)于溫度和濕度適宜的環(huán)境中，光照周期為光照和黑暗各 12 h。12 只比格犬隨機分為心肌梗死組（MI 組，行左前降支結(jié)扎術，n＝6）和對照組（僅開胸不結(jié)扎動脈，n＝6），本研究方案由武漢大學動物實驗倫理委員會批準進行。

1.2 建立心肌梗死模型及取材

所有比格犬通過前肢靜脈注射3%戊巴比妥（劑量為30 mg/kg）進行麻醉，并以2 mg/（kg·h）維持麻醉狀態(tài)。麻醉后將比格犬置于手術臺，行氣管插管連接正壓呼吸機通氣，調(diào)整氧流量4～ 6 L/min。右側(cè)股靜脈置管建立靜脈通道，滴注生理鹽水。持續(xù)監(jiān)測體表心電圖（Lead7000，四川錦江電子科技有限公司）。整個實驗過程中，于比格犬下方放置電熱板以維持正常體溫。所有比格犬取右側(cè)臥位，經(jīng)左側(cè)第四肋間開胸，剪開心包，暴露心臟。小心分離冠狀動脈左前降支，在距離左前降支起始處約2 cm 的下方穿入1 根3/0 線，結(jié)扎左前降支建立心肌梗死模型。模型建立成功標志：心肌缺血區(qū)域出現(xiàn)局部發(fā)紺，心電監(jiān)測示Ⅱ?qū)?lián)ST 段明顯改變（≥0.1 mV 抬高或壓低）。保持結(jié)扎1 h。對照組比格犬行相同操作但不結(jié)扎。安樂死處死動物，于左側(cè)第三肋間開胸，收集LSG，解剖學位置如圖1 所示，所有比格犬的取材操作均于20∶00～24∶00 間完成。

圖1 左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)的解剖位置

1.3 時鐘基因檢測

Trizol 法提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix 進行熒光實時定量聚合酶鏈反應（qRTPCR），引物由上海生工生物工程公司提供，引物序列見表1，實驗條件為95 ℃ 10 min 預變性，95 ℃ 15 s 變性，60 ℃ 30 s 退火/延伸，40 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表 達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均通過Shapiro-Wilk 檢驗是否符合正態(tài)分布。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗對組間差異進行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死對LSG中核心時鐘基因表達的影響

與對照組相比，MI 組Per2的mRNA 表達水平顯著降低，Cry1、Cry2的mRNA 表達水平顯著升高（P均＜0.05），Bmal1、Clock和Per1的mRNA 表達水平變化不顯著。見表2。

表2 2組LSG中核心時鐘基因mRNA表達水平比較

2.2 心肌梗死對LSG中鐘控基因表達的影響

與對照組相比，MI 組Nr1d1的mRNA 表達水平顯著降低，Tim的mRNA 表達水平顯著升高，（P均＜0.05），Nr1d2、Rorα的mRNA 表達水平變化不顯著。見表3。

表3 2組LSG中鐘控基因mRNA表達水平比較

3 討論

近年來，心肌梗死在我國的發(fā)病率及病死率呈上升趨勢[5]。研究表明，心肌梗死后猝死事件（如室性快速性心律失常）的發(fā)生具有明顯的晝夜分布特點，表現(xiàn)出典型的清晨發(fā)病高峰，但其機制尚不清楚[2-3]。既往研究顯示，心臟交感神經(jīng)節(jié)即LSG的過度激活是心肌梗死后猝死事件發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，LSG 的神經(jīng)活性同樣具有晝夜節(jié)律性[6]，提示心肌梗死后猝死事件發(fā)生的晝夜分布可能與LSG的晝夜節(jié)律相關。

哺乳動物的生物鐘系統(tǒng)由位于下丘腦視交叉上核（SCN）的中央時鐘與位于外周組織中的外周時鐘構(gòu)成[7]。其中，中央時鐘是控制機體晝夜節(jié)律的主要部分，其通過視網(wǎng)膜接受光信號實現(xiàn)與外界環(huán)境的同步，并經(jīng)神經(jīng)體液途徑（自主神經(jīng)張力、體溫和糖皮質(zhì)激素等）整合外周時鐘，從而使機體與環(huán)境、不同器官間保持同步，調(diào)節(jié)生理活動。本團隊前期通過將跨突觸逆行示蹤病毒——偽狂犬病病毒注射至大鼠心肌組織中，發(fā)現(xiàn)頸上神經(jīng)節(jié)（SCG，與LSG 功能類似）、下丘腦室旁核（PVN，交感神經(jīng)中樞）和SCN 處均出現(xiàn)了偽狂犬病病毒標記的神經(jīng)元，說明可能存在“SCN-PVN-SCG-心臟”交感神經(jīng)軸，進一步研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂可通過激活該交感神經(jīng)軸，使心肌梗死后的心臟重構(gòu)惡化，提示心臟交感神經(jīng)節(jié)可以直接受到中央時鐘的調(diào)控，從而影響心肌梗死后心臟功能的改變[8]，然而目前關于心臟交感神經(jīng)節(jié)的外周時鐘基因在心肌梗死前后的改變情況仍不清楚。為了更好地反映人類LSG 時鐘基因在心肌梗死前后的表達改變，本研究采用了與人類生活作息相同（晝出夜伏）的比格犬作為實驗動物，通過結(jié)扎左前降支構(gòu)建心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)MI 組LSG 中Per2、Nr1d1的表達顯著降低，Cry1、Cry2、Tim的表達顯著升高。

在生理狀態(tài)下，核心時鐘基因及鐘控基因通過形成一系列復雜的TTFL 實現(xiàn)晝夜波動[9]。核心TTFL 主要由4 個核心時鐘基因蛋白驅(qū)動：2 個正向調(diào)節(jié)因子（Bmal1 和Clock）和2 個負向調(diào)節(jié)因子（Per 和Cry）。首先，核心時鐘基因蛋白Bmal1 和Clock 在細胞核中結(jié)合形成異二聚體，并與Cry和Per基因啟動子區(qū)域的E-box 結(jié)合，激活它們的轉(zhuǎn)錄。隨后，Per 和Cry 蛋白在細胞質(zhì)中聚集，結(jié)合形成異二聚體并重新轉(zhuǎn)移至細胞核中，抑制Bmal1-Clock 異二聚體介導的基因轉(zhuǎn)錄過程[9]。除此之外，Bmal1-Clock 異二聚體還可以激活鐘控基因（如Nr1d1、Nr1d2、Rorα）的轉(zhuǎn)錄，而Nr1d1/Nr1d2 和Rorα 的積累又可以通過與Bmal1啟動子區(qū)域的核受體反應元件結(jié)合，分別抑制和促進Bmal1的表達，進一步維持該反饋環(huán)路的穩(wěn)定性[10]。本研究結(jié)果顯示心肌梗死會導致LSG 核心時鐘基因的負向調(diào)節(jié)因子Per2表達顯著降低，Cry1、Cry2表達顯著升高，而正向調(diào)節(jié)因子Bmal1和Clock的表達則無明顯改變。本研究同樣發(fā)現(xiàn)心肌梗死會導致LSG中鐘控基因的負向調(diào)節(jié)因子Nr1d1表達顯著降低，而對正向調(diào)節(jié)因子Rorα的表達無明顯影響。這些結(jié)果提示心肌梗死主要影響LSG 內(nèi)TTFL 負向調(diào)節(jié)因子的表達。

Tim基因最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，其編碼的Tim蛋白主要通過與Per 蛋白結(jié)合，以異二聚體的形式轉(zhuǎn)入細胞核中抑制Per基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與維持果蠅正常的晝夜節(jié)律[11]。目前關于Tim 蛋白在哺乳動物中的作用尚不清楚。Barnes 等[12]通過選擇性敲除小鼠SCN 中Tim基因發(fā)現(xiàn)，Tim表達下調(diào)可顯著降低Per 蛋白的表達，升高Cry 蛋白的表達，并嚴重破壞SCN 的晝夜節(jié)律，表明Tim很可能也參與了哺乳動物晝夜節(jié)律的維持。除了驅(qū)動晝夜節(jié)律外，近年來研究表明Tim 還與細胞周期、DNA復制及DNA 損傷有關[13]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死顯著地增加了LSG 中Tim基因的轉(zhuǎn)錄水平，但降低了Per2的表達，升高了Cry1/Cry2的表達，這與Barnes 等[12]的研究結(jié)果并不一致，提示心肌梗死很可能是通過其他機制影響Tim的表達，其中的潛在機制需要進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死主要影響LSG內(nèi)TTFL 的負向調(diào)節(jié)因子（Per2、Cry1、Cry2及Nr1d1）的表達，推測這可能與心肌梗死后猝死事件發(fā)生的晝夜分布有關。后續(xù)研究將進一步驗證LSG 內(nèi)TTFL 的負向調(diào)節(jié)因子的表達改變與猝死事件發(fā)生的聯(lián)系及潛在機制。此外，基于Tim 在心肌梗死前后的顯著改變，我們推測Tim 很可能參與了該過程。