新生SD大鼠心房肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及改良

汪尊冬 李蔚 曾臻 胡永勝 劉維琴

在心血管疾病的基礎(chǔ)研究中，常用的動物模型包括動脈粥樣硬化模型[1]、心房顫動模型[2]、心肌缺血模型[3]等。除動物模型外，細(xì)胞模型可以排除動物體液、神經(jīng)等因素對實驗的干擾，能更直觀地展示疾病對心血管組織的影響。心肌細(xì)胞可分為心房肌細(xì)胞與心室肌細(xì)胞，目前被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可的永生型心室肌細(xì)胞為H9C2[4]，心房肌細(xì)胞系為HL-1[5]，但是HL-1 培養(yǎng)條件復(fù)雜，在國內(nèi)市場銷售較少，且售價昂貴。本研究旨在探索并改良體外原代培養(yǎng)心房肌細(xì)胞的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生1～3 d 的SD 乳鼠15 只，雌雄不拘，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 心房肌細(xì)胞的提取及純化 所有操作均在超凈臺進(jìn)行。（1）取1～3 d 的SD 乳鼠，用75%酒精浸泡約10 s；（2）采用“三指法”提捏乳鼠，用眼科剪從胸骨旁剪出約1 cm 切口，擠出心臟，放于提前預(yù)冷的D-Hank’s 溶液中；（3）清洗至溶液澄清，并去除血凝塊；（4）在體視顯微鏡下剪除左右心耳、結(jié)締組織、大血管及心室，保留心房組織；（5）將心房組織移入培養(yǎng)皿中，用0.25%胰酶覆蓋心房組織，然后用封口膜將培養(yǎng)皿封閉，將培養(yǎng)皿放于4 ℃冷庫消化5～6 h；（6）5～6 h 后用與0.25%胰酶消化液等體積的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，將組織剪碎成1 mm3大?。唬?）將組織碎塊倒入15 mL 離心管中，加入終濃度為0.1%Ⅱ型膠原酶＋0.5%BSA 消化液4 mL，放于37.5 ℃恒溫水浴鍋中，消化2～3 次可將組織碎塊消化干凈，每次 12 min，并收集上清；（8）將含細(xì)胞的消化液用等體積含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，并用 200 目過濾網(wǎng)濾除組織碎塊，收集上清；（9）將收集到的含細(xì)胞上清液離心，1 000 轉(zhuǎn)/min，5 min；（10）離心后去除上清，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基吹散細(xì)胞沉淀，將含細(xì)胞的培養(yǎng)基移入直徑 60 mm 的培養(yǎng)皿中，差速貼壁90 min；（11）90 min后將含細(xì)胞的培養(yǎng)基移入50 mL 離心管中，使用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，以1×106/mL 種植細(xì)胞，種植前加入Brd U，使Brd U 終濃度為0.1 mmol/L，以抑制成纖維細(xì)胞生長；（12）36～48 h 后更換為不含Brd U 的正常含血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫熒光鑒定 72 h 后細(xì)胞鋪滿細(xì)胞爬片約80%，將細(xì)胞爬片取出。用PBS 清洗細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛固定爬片15 min；然后用0.5%Triton X-100 室溫通透細(xì)胞爬片，用山羊血清封閉細(xì)胞爬片30 min；孵育一抗（小鼠抗大鼠α-actin 1∶100；兔抗大鼠肌鈣蛋白T 1∶100），4℃孵育過夜。第二天用PBS 清洗細(xì)胞爬片，加入熒光二抗（FITC-羊抗小鼠IgG 1∶100；CoraLite594 conjugate-羊抗兔IgG 1∶100），37 ℃孵育1 h；復(fù)染細(xì)胞核，滴加DAPI 避光孵育5 min（從滴加熒光二抗開始，后續(xù)步驟均要避光操作）；最后滴加抗熒光淬滅劑，用倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

36 h 后鏡下可見細(xì)胞已經(jīng)貼壁，貼壁細(xì)胞形狀不一，有梭形、三角形，還有一部分形狀不規(guī)則（見圖1），少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)搏動；72 h 細(xì)胞聚合成片，細(xì)胞搏動逐漸同步。72 h 后細(xì)胞鋪滿細(xì)胞爬片約90%，可用于免疫熒光鑒定與HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)（見圖2）。陽性細(xì)胞（心房肌細(xì)胞）可表達(dá)α-actin蛋白與心肌肌鈣蛋白T，同時用DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，可觀察陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比，結(jié)果表明心房肌細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)超過95%（見圖3）。

圖1 心房肌細(xì)胞培養(yǎng)36 h（×100）

圖2 心房肌細(xì)胞培養(yǎng)72 h后HE染色（×200）

圖3 培養(yǎng)細(xì)胞免疫熒光鑒定（×100）

目前多數(shù)文獻(xiàn)采用“兩步法”提取心肌細(xì) 胞[6-7]，使用0.25%胰酶4 ℃消化心肌組織過夜，第二天繼續(xù)用膠原酶消化細(xì)胞。本研究也嘗試分別使用0.25%以及0.125%胰酶消化心肌組織過夜，但是過夜時間難以控制。實驗結(jié)果顯示，72 h 后鏡下見過夜消化的心肌細(xì)胞較使用0.25%胰酶4 ℃消化5～6 h 所獲得的心肌細(xì)胞明顯減少（見圖4）。

圖4 不同消化法消化后心房肌細(xì)胞培養(yǎng)72 h（×100）

3 討論

心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)是心血管疾病研究的基本技術(shù)，市場上雖有H9C2、HL-1 出售，但是永生化細(xì)胞的某些生理特性與原代提取的心肌細(xì)胞存在差異。在研究心肌細(xì)胞的電生理、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及藥物毒性等，通常需要原代培養(yǎng)的純度較高、活力較好心肌細(xì)胞。本研究（兩步法提取原代心肌細(xì)胞）在現(xiàn)有文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，明顯提高了細(xì)胞的收獲率。

本研究的創(chuàng)新點在于將胰酶聯(lián)合膠原酶同時消化心肌組織（一步法）改為“兩步法”，同時提高胰酶濃度而縮短胰酶消化時間。目前較多的文獻(xiàn)采用“一步法”提取心肌細(xì)胞[8-10]。當(dāng)使用胰酶和（或）Ⅱ型膠原酶混合同時進(jìn)行消化時，消化時間難以掌握，若消化過度則容易使細(xì)胞中的DNA與膠原混合，形成黏液狀物質(zhì)，使含細(xì)胞的上清液難以從消化體系中分離，細(xì)胞量明顯減少而影響細(xì)胞收獲率。而使用“兩步法”提取原代心肌細(xì)胞則可明顯減少黏液狀物質(zhì)，當(dāng)將心房組織放置于4 ℃環(huán)境中消化時，0.25%的胰酶可以緩慢消化組織，使得心房組織變得疏松，再使用Ⅱ型膠原酶消化時可以迅速消化細(xì)胞間的膠原纖維，大大提高細(xì)胞收獲率。王偉等[10]采用兩次差速貼壁（45 min/次）分離成纖維細(xì)胞。本研究初期使用兩次差速貼壁，發(fā)現(xiàn)第二次差速貼壁所獲得的成纖維細(xì)胞甚少，故采用90 min 差速貼壁分離成纖維細(xì) 胞[10]。一次差速貼壁聯(lián)合0.1 mmol/L Brd U 可明顯減少成纖維細(xì)胞的含量，較兩次差速貼壁明顯降低了提取成本。

本研究的另一個創(chuàng)新點是Ⅱ型膠原酶與BSA的聯(lián)合使用，BSA 可以降低消化酶對細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞的活性。此外，可以先將Brd U 配制成 10 mmol/L 溶液，待差速貼壁完成后,按1 mL 含細(xì)胞培養(yǎng)基加10 μLBrd U，可以減少離心次數(shù)，降低細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力。鑒定方面，大多數(shù)研究只采用α-actin 蛋白熒光染色鑒定[9-11]，Burstein 等[12]在實驗中發(fā)現(xiàn)，有95%首代的成纖維細(xì)胞表達(dá)α-actin 蛋白，故本研究采用α-actin 蛋白聯(lián)合心肌肌鈣蛋白T 的雙熒光法鑒定。

綜上所述，采用“兩步法”（使用0.25%胰酶4 ℃消化心房肌組織5～6 h，然后用0.1%Ⅱ型膠原酶＋0.5%BSA 消化液消化心房組織）可更有效地培養(yǎng)原代心房肌細(xì)胞。