觀賞植物花藥培養(yǎng)及其影響因素研究進展

牛文霞

（廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360）

觀賞植物具有一定的觀賞價值，是改善美化生活環(huán)境的草本和木本植物的總稱。我國的觀賞植物資源非常豐富，被譽為“世界園林之母”?；ㄋ幣囵B(yǎng)是指用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，把發(fā)育到一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上，以改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育途徑，形成胚狀體或愈傷組織，隨后分化成完整的植株[1]。花藥培養(yǎng)誘導獲得的花粉植株是從減數(shù)分裂后的小孢子發(fā)育而來，因此一般為單倍體，再經(jīng)染色體加倍處理后即為純合二倍體?；ㄋ幣囵B(yǎng)具有可以在較短的時間內(nèi)獲得基因純合的植株、縮短育種年限、后代遺傳變異類型豐富、選擇效率高等優(yōu)點，因此成為觀賞植物重要的育種技術(shù)手段之一[2]。文章分析總述了觀賞植物花藥培養(yǎng)技術(shù)的研究進展和影響因素，以期為觀賞植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 觀賞植物花藥培養(yǎng)研究進展

自1964 年Guha&Maheshwari 從毛葉曼陀羅的離體花藥中成功誘導出單倍體植株之后[3]，國內(nèi)外紛紛開展花藥研究。目前，花藥離體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在許多觀賞植物上得到應(yīng)用，花藥培養(yǎng)技術(shù)也日趨完善，成為一種快速有效的育種途徑。

李艷敏等（2021）[4]用粉玉奴芍藥離體花藥，在不同濃度2，4-D 培養(yǎng)基中，研究愈傷誘導率、體胚發(fā)生和成苗發(fā)生的影響，在成苗培養(yǎng)基中得到了單倍體材料。田丹青等（2020）[5]以處于單核期的紅掌花藥為材料，經(jīng)愈傷組織途徑成功獲得紅掌單倍體新材料。段青等（2013）[6]以洋桔梗48 個品種為材料，成功得到單倍體材料。王偉光（2005）[7]以地被菊為材料研究單倍體培養(yǎng)，鏡檢結(jié)果表明地被菊花藥培養(yǎng)獲得的單倍體植株所占比例為2%～3%。Jian L J&Chen XY（2005）[8]使用中國水仙的花藥作為愈傷組織誘導和植物再生的外植體，為其他水仙花的離體大量繁殖提供新思路。

花藥培養(yǎng)已經(jīng)與常規(guī)雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展成了一套技術(shù)體系。經(jīng)過50 年的研究發(fā)展，花藥培養(yǎng)已經(jīng)在許多觀賞植物上取得成功。對于觀賞植物，應(yīng)用花藥培養(yǎng)獲得單倍體，進而獲得純合二倍體，再進行無性繁殖方式保持優(yōu)良的基因型，具有十分重要的價值。

目前主要有兩種獲得單倍體的途徑。一種是自然條件下發(fā)生的孤雌生殖或孤雄生殖，易受天氣等因素影響，單倍體植株的發(fā)生率非常低[9-10]。另一種是人工誘導單倍體，主要有未受精的雌核（未受精的子房和胚珠等）和雄配子體（花粉和花藥）離體培養(yǎng)。對未受精的子房和胚珠的研究較多地集中在禾本科、茄科、葫蘆科等，然而在觀賞植物中進行誘導單倍體的研究較少[11-17]?；ǚ郏ㄐ℃咦樱┡囵B(yǎng)相對來說操作較為復雜，而花藥培養(yǎng)為器官培養(yǎng)，是獲得單倍體的一種重要方式[18]。

2 觀賞植物花藥培養(yǎng)影響因素

2.1 供體植株基因型

眾多花藥培養(yǎng)研究表明，同一物種的不同亞種乃至品種在誘導率上表現(xiàn)出極大的差異。

段青等（2013）研究洋桔?；ㄋ庪x體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，洋桔?；ㄋ幱鷤T導率與植株品種的基因型密切相關(guān)，其胚狀體誘導率差異也較大。王延玲等（2006）[19]用仙客來雜交種和后代品種進行花藥離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，雜交種的愈傷誘導率高于后代的誘導率，可能是由于不同的基因型導致小孢子發(fā)育的方向不同。褚云霞等（2002）[20]以6 個百合品種花藥為外植體進行組織培養(yǎng)誘導產(chǎn)生愈傷組織，研究表明，百合花藥誘導愈傷組織的能力存在顯著的基因型差異。代色平和包滿珠（2003）[21]在研究矮牽?；ㄋ庪x體培養(yǎng)中提到基因型是決定矮牽牛花藥培養(yǎng)誘導率的重要因素。

2.2 花粉發(fā)育時期

花藥發(fā)育時期對于花藥培養(yǎng)至關(guān)重要，已在所有的花藥培養(yǎng)中得到證實。因此，花藥發(fā)育時期的確定是花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟。一般來說，植物在上午時細胞處于旺盛的分裂期，是取材的最佳時候。

田丹青等（2020）以處于單核期的紅掌花藥為材料，成功獲得紅掌單倍體。褚云霞等（2001）[22]在百合的花藥研究中發(fā)現(xiàn)小孢子最適培養(yǎng)時期為單核期。K.C.Engvild（1973）[23]研究表明，處于單核期的矮牽牛小孢子培養(yǎng)易獲得單倍體，雙核期易獲得二倍體，而雙核晚期易產(chǎn)生三倍體植株。王延玲等（2004）[24]研究仙客來花藥培養(yǎng)時，選用花粉發(fā)育時期為單核靠邊期的材料進行花藥培養(yǎng)研究。段青等（2013）研究洋桔?；ㄋ幣囵B(yǎng)時，也是采用單核靠邊期的洋桔?；ɡ龠M行花藥培養(yǎng)。朱向濤等（2010）[25]研究表明，在牡丹花藥培養(yǎng)中，處于單核期的材料愈傷誘導率較高。

不同生育期的花粉培養(yǎng)效應(yīng)差別較大。對大多數(shù)觀賞植物來說，用單核期的花粉培養(yǎng)易產(chǎn)生單倍體植株。在培養(yǎng)花粉之前，應(yīng)制片鏡檢以確定花粉發(fā)育時期，找出與花粉發(fā)育時期相應(yīng)的形態(tài)學指標，運用一些簡單可靠的植株外形、花蕾或花藥的形態(tài)特征來確定花粉發(fā)育時期。

小孢子形成和發(fā)育是一個連續(xù)的過程，有研究將紅掌小孢子形成和發(fā)育過程分為小孢子母細胞形成期、小孢子母細胞減數(shù)期、小孢子早期、小孢子中期、小孢子晚期、二胞花粉期和成熟花粉期等幾個階段。在紅掌花藥培養(yǎng)中，可以根據(jù)紅掌肉穗花序的發(fā)育特征來大致確定花藥的發(fā)育時期。四分體期的花序外部特征是苞片未展，小花呈淡紅色；小孢子時期對應(yīng)的是苞片即將展開到完全展開，小花紫紅色，此時柱頭還未伸出；當柱頭伸出后，小孢子進入二胞花粉期。小孢子發(fā)育時期與花序長度沒有必然的關(guān)系。

2.3 預(yù)處理

在花藥培養(yǎng)前，對花芽或者花藥進行預(yù)處理能有效提高花藥愈傷誘導率，其中最有效的是低溫處理[26-27]。一般耐寒植物比喜溫植物可耐受較低的溫度。低溫處理可以打破正常的有絲分裂，改變紡錘絲方向，破壞紡錘絲的蛋白，最終阻礙紡錘絲的形成，使得花粉朝著胚胎的方向發(fā)育，從而導致組織分化。低溫處理可以延緩花粉退化，維持花粉發(fā)育的生理環(huán)境[28]。低溫處理還可以明顯提高花粉愈傷組織的質(zhì)量和產(chǎn)量，例如對曼陀羅花芽進行低溫預(yù)處理后顯著提高了愈傷誘導率[29]。代色平和包滿珠（2004）[30]研究認為，低溫預(yù)處理能顯著提高矮牽?；ㄋ幍恼T導率。萬壽菊花藥培養(yǎng)低溫預(yù)處理4 ℃時處理7 d，溫度7～8 ℃時則需要處理8～10 d。但對百合低溫預(yù)處理沒有效果。因此，最佳處理溫度和時間因材料而異，溫度較低需要放置較短的時間，溫度較高需要放置較長的時間。

2.4 基本培養(yǎng)基

目前用于觀賞植物花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基有MS、N6、Nitch、White、B5 等。培養(yǎng)基的狀態(tài)有固體、液體和固液混合體。通常來說，液體培養(yǎng)基更有利于花粉啟動和誘導愈傷，也有利于消除花藥壁的抑制。在培養(yǎng)小孢子時，液體培養(yǎng)基和固液混合培養(yǎng)基更有利于小孢子的游離與培養(yǎng)。在花藥培養(yǎng)中，固體培養(yǎng)基更適合于絕大部分觀賞植物的花藥離體培養(yǎng)，在固體培養(yǎng)條件下花藥愈傷誘導率明顯優(yōu)于液體培養(yǎng)[31-34]。

2.5 培養(yǎng)基附加成分

在培養(yǎng)基的各種成分中，植物激素是愈傷組織產(chǎn)生和分化的關(guān)鍵性因素，花粉發(fā)育成愈傷組織還是胚狀體很大程度上取決于培養(yǎng)基中的激素種類和濃度，但這些激素有哪些互作作用還沒有確定。大量研究證明，適當加入生長激素（2，4-D）和分裂素（KT 和6-BA）有利于促進愈傷誘導，而在后期植物成苗階段則需要較低的生長素和細胞分裂素。

曹曉燕等（2003）[35]研究認為，配合使用6-BA 和NAA 可以提高花藥愈傷誘導率，若單獨使用6-BA 花藥愈傷誘導率為0。朱向濤等（2010）研究認為，在牡丹花藥培養(yǎng)中，2，4-D 發(fā)揮著重要作用，其誘導愈傷組織的頻率隨著濃度的增大而增加，但誘導出的愈傷組織的分化能力顯著降低，后期可能會褐化或死亡。該結(jié)果在百合的花藥培養(yǎng)中也得到了證明。李甫等（2007）[36]研究認為，在萬壽菊花藥培養(yǎng)中，NAA 對愈傷組織的誘導率要高于2，4-D，而作為細胞分裂素的KT 和6-BA 則沒有明顯差異。

碳源是植物組培中的重要元素，蔗糖是多數(shù)植物花藥培養(yǎng)研究中最常見的碳源。近年來，葡萄糖、果糖被越來越多地應(yīng)用。蔗糖的濃度過高或過低都會影響植物愈傷組織的形成，可能與花粉細胞的滲透壓有關(guān)。在對紫荊、牡丹等植物的花藥培養(yǎng)中，蔗糖濃度在10%～15%，愈傷誘導率較高；在對毛刺槐的花藥培養(yǎng)中，蔗糖濃度從30 g/L 增加至90 g/L，愈傷誘導率也隨之增加。一般在花藥培養(yǎng)中采用蔗糖濃度3%～15%。

在花藥培養(yǎng)過程中，也會加入一些谷氨酸、水解乳蛋白等來提高胚狀體的誘導。也會給培養(yǎng)基中加入活性炭，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中元素的比例，促進胚狀體形成?；钚蕴靠梢蕴岣咧参锏某雒缏?，對植株的根長、根數(shù)、苗高、鮮重均有影響。在花藥培養(yǎng)愈傷誘導階段，花藥會不斷釋放褐色物質(zhì)，導致花藥逐漸變褐死亡，從而影響愈傷組織的誘導形成。一般為防止愈傷組織褐化，通常會在培養(yǎng)基中適當加入一些維生素、椰汁等[37]。

2.6 培養(yǎng)條件

在植物花藥培養(yǎng)中，光照、溫度對愈傷組織的形成和分化起著較大作用?；ㄋ幣囵B(yǎng)不同時期對光照的需求也不同。在花藥愈傷組織誘導階段若光照較強和溫度較高，均會提高氧化酶的活性，從而促進酚類物質(zhì)氧化而引起材料褐化。大多數(shù)研究證明，在誘導愈傷和胚胎時期適宜進行暗培養(yǎng)或者散射光培養(yǎng)，在后期幼苗分化階段需進行強光培養(yǎng)。

3 問題與展望

盡管花藥培養(yǎng)已在許多觀賞植物中取得了較大進展，但仍得不到廣泛應(yīng)用。由于誘導頻率及分化率較低，花藥壁、花絲等二倍體細胞的干擾，白化苗問題，培養(yǎng)過程中污染性高、重復性差、增殖慢、容易褐化死亡，至今尚未建立一套高效的花培再生體系，對花藥培養(yǎng)中脫分化啟動機理以及花藥壁的影響還缺乏認識。在后期對花藥培養(yǎng)出的植株進行準確的倍性鑒定是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)?？赏ㄟ^分子標記對控制花培能力的基因進行組合，提高花培的誘導率，建立穩(wěn)定且可重復的培養(yǎng)體系。應(yīng)結(jié)合各種影響因素，尋找高效的組培技術(shù)，將雜交育種、抗病育種、誘變育種、分子育種等相結(jié)合，拓寬花培育種的應(yīng)用領(lǐng)域，使花培技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。