組學技術在銀屑病研究中的應用*

黎莉，夏琦，危建安，盧月，韓凌，盧傳堅

[廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院（廣東省中醫(yī)院）省部共建中醫(yī)濕證國家重點實驗室，廣東廣州 510006]

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導的慢性、復雜性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。其典型臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，局限或廣泛分布，無傳染性，治療困難，常罹患終身。銀屑病病因復雜以致治療靶點和機制復雜[1]。組學技術具有高通量的特點，有可能快速全面地發(fā)現(xiàn)銀屑病機制與藥物療效相關的潛在生物標志物，為銀屑病發(fā)病潛在的分子機制和信號通路提供新的研究方向，加速銀屑病治療藥物研究的步伐。目前，在代謝組學、蛋白質組學、基因組學、轉錄組學、腸道微生物組學方面，已發(fā)現(xiàn)了一些有參考價值的銀屑病生物標志物和靶標。另外，銀屑病的診斷方法主要為皮膚病變的臨床形態(tài)學評估。皮膚活檢標本的組織病理學分析是目前常見的臨床鑒別輔助方法，但皮膚活檢屬于侵入性、有創(chuàng)性檢查，且銀屑病早期階段的病理改變并不明顯。因此，開發(fā)對銀屑病具有高度敏感性和特異性的非侵入性診斷方法或生物標志物具有積極的臨床意義，對醫(yī)師制訂個性化的治療方案有參考價值。組學技術的發(fā)展和應用對銀屑病生物標志物發(fā)現(xiàn)、檢測和監(jiān)測，以及對銀屑病治療藥物的應用、藥物作用靶點的篩選、患者不同證型病程的研究均可提供有力佐證。本綜述總結組學技術在銀屑病診斷、治療、生物標志物發(fā)現(xiàn)等方面的研究成果，為后續(xù)銀屑病研究提供參考。

1 代謝組學在銀屑病研究中的應用

1.1 代謝組學對銀屑病的研究

代謝組學（Metabonomics）是20 世紀90年代中期發(fā)展起來的繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后的一門新學科。代謝組學定量測量生物系統(tǒng)對病理生理刺激或遺傳修飾的動態(tài)多參數(shù)的代謝反應，即通過研究生物體受內部或外部刺激后，內源性代謝物種類、數(shù)量的變化，或隨時間的變化規(guī)律及其相互關系。

代謝組學臨床檢測樣本多來源于正常人和銀屑病患者的尿液、血漿、血清、皮膚組織提取液，常運用核磁共振光譜技術（NMR）和質譜技術（MS）探究樣本內源性差異代謝物的含量和種類的變化[2]。KANG 等[3]采用GC-MS 全掃描模式非靶向代謝組學方法和離子監(jiān)測靶向代謝組學方法，分析銀屑病患者和健康人群血清差異，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者氨基酸水平升高，包括鳥氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺及支鏈氨基酸，糖酵解活性提高，如乳酸增加，而脂肪酸生物合成途徑明顯減少，表現(xiàn)為巴豆酸和壬二酸水平降低，提供了可能與銀屑病發(fā)病機制和診斷相關的生物標志物。劉英等[4]通過超導傅里葉變化核磁共振波譜儀對尋常銀屑病患者血漿內源代謝物進行了核磁共振氫譜檢測，發(fā)現(xiàn)患者血漿中脂類、多種氨基酸、有機酸、脂肪酸等含量顯著高于正常人，說明銀屑病發(fā)生與脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、丙酮酸代謝、糖異生、糖酵解、葡萄糖-丙氨酸循環(huán)等紊亂有關。ARMSTRONG 等[5]采用氣相色譜飛行時間質譜對比分析銀屑病患者、銀屑病關節(jié)炎患者及健康人的血清代謝物，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血清α-酮戊二酸水平較高，天冬酰胺含量較低，谷氨酰胺水平較低，與對照組比較，銀屑病患者和銀屑病關節(jié)炎患者的葡萄糖醛酸水平升高，代謝產物的差異有助于闡明銀屑病和銀屑病關節(jié)炎的發(fā)病機制，并可能為治療提供新方案。這些研究結果說明銀屑病非單純皮膚病，是集代謝紊亂、免疫異常、炎癥反應于一體的全身性疾病。

1.2 代謝組學對銀屑病證候差異的研究

代謝組學探究中醫(yī)藥，證型“質”的研究最為熱門。證本質研究是證型規(guī)范化的前提與基礎，以定性定量的方式探索中醫(yī)“證”的診斷或評價指標，試圖通過內源性代謝物的差異和變化規(guī)律闡述中醫(yī)辨證分型的本質。劉衛(wèi)紅等[6]采用核磁共振氫譜檢測血熱證銀屑病患者治療前后的血漿，與正常對照比較，患者血漿中極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、脂肪酸、不飽和脂肪酸，以及中間代謝產物如羥基丁酸、丙酮、乳酸顯著增加，表明血熱證銀屑病患者存在脂代謝紊亂，并伴隨基酸代謝障礙，涼血解毒法給藥后患者血漿中不飽和脂肪酸含量下調，表明藥物有效調節(jié)脂代謝紊亂。

1.3 代謝組學對銀屑病并發(fā)癥的相關研究

銀屑病，除了皮膚改變，還隱含眾多并發(fā)癥風險，甚至可致殘或危及生命。銀屑病病情發(fā)展到一定程度，患者可能出現(xiàn)的并發(fā)癥與免疫系統(tǒng)功能及代謝紊亂聯(lián)系緊密[7]，包括銀屑病關節(jié)炎、代謝綜合征及心血管疾病。無偏性的測序方法[8]結果表明炎癥小體是銀屑病與對照的最大差異物質，且與IL-6和促炎內皮轉錄物相關，解釋了銀屑病患者心血管疾病的風險增加。

1.4 代謝組學在銀屑病網(wǎng)絡藥理學中的應用

代謝組學具有高通量、準確性、系統(tǒng)性的特點，通過高通量色譜與質譜聯(lián)用技術，首先鑒定銀屑病代謝組學的生物標志物[9]，然后結合網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫可構建代謝組學生物標志物-酶網(wǎng)絡、生物標志物-中藥藥效網(wǎng)絡、生物標志物-信號通路網(wǎng)絡等，用于尋找銀屑病致病的關鍵點。GU 等[10]利用代謝組學實驗結果中篩選出的關鍵生物標志物和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫篩查的酶及關鍵蛋白質，采用分子對接技術，計算生物標志物與酶和蛋白質的結合能，發(fā)現(xiàn)結合能高的蛋白質和酶，引入結合能量加權多藥理學指數(shù)來評估通路的相關性，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號通路與其他5 種通路可能是銀屑病發(fā)生發(fā)展的關鍵通路，再結合實驗進行驗證，這無疑減少了干擾，加快了研究速度，有利于深入研究。

1.5 代謝組學在藥物治療中的應用

當藥物給藥方式或中藥組方配比不精確時，藥物開發(fā)就會受阻，代謝組學能通過科學有效的方法，為研究提供客觀證據(jù)。LU 等[11]采用LC-MS 技術分析中藥治療前后銀屑病患者及健康對照人群的晨尿代謝物變化，結合銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）評分指標，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者給藥前后晨尿中代謝物的變化且向健康對照人群轉歸的趨勢，發(fā)現(xiàn)藥物可能作用的代謝通路。

2 蛋白質組學在銀屑病研究中的應用

蛋白質組學是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用，并由此獲得蛋白質水平上的關于疾病的發(fā)生，細胞生理、生化、代謝，以及調控網(wǎng)絡等過程的整體而全面的認識。在過去的20年中，蛋白質組學被廣泛地應用于銀屑病發(fā)病機制研究、診斷和預測生物標志物，以及監(jiān)測藥物療效和毒性的研究[12]。蛋白質組學多從血清蛋白質組學角度探究銀屑病[13]，普遍采用雙向凝膠電泳及液相質譜聯(lián)用技術，通過發(fā)現(xiàn)血清蛋白的表達差異，以期從蛋白質水平揭示尋常型銀屑病的發(fā)病機制和銀屑病不同證型的物質基礎。吳瑋等[14]通過雙向電泳/基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術，探尋了尋常銀屑病患者血漿與正常人的差異蛋白點，以及血熱證、血瘀證、血燥證3 種證型之間血漿差異蛋白點。REINDL 等[15]對158 例銀屑病患者、銀屑病關節(jié)炎患者及健康對照者血漿樣本開展非凝膠蛋白質組學分析，鑒定出208 個變異蛋白，并對15 個候選生物標志物進行酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）驗證，用于無偏診斷銀屑病和銀屑病關節(jié)炎。其中4 個已識別的候選標志物（鋅-α2-糖蛋白、補體C3、聚合免疫球蛋白受體及血漿激肽釋放酶）可以單獨使用，多個標志物的組合能夠提高診斷的敏感性和特異性。

隨著質譜技術的更新及蛋白質芯片技術的發(fā)展，血清蛋白質組學檢測手段越發(fā)先進，研究方法更為精確靈敏。XU 等[16]開發(fā)的新型可訂制抗體芯片技術和數(shù)據(jù)非依賴采集模式（data-independent acquisition，DIA）質譜檢測技術聯(lián)用，通過分析血清蛋白與銀屑病臨床數(shù)據(jù)的相關性，發(fā)現(xiàn)3 個與PASI 相關的血清蛋白（PI3，CCL22、IL-12B）和2 個與瘙癢指數(shù)（VAS）相關的血清蛋白（TNFRSF8、CD14），其中PI3 蛋白非常有希望用于銀屑病的早期檢測和臨床的嚴重程度評估，顯示出蛋白質組學在銀屑病精確醫(yī)學中的應用潛力。

皮膚組織的蛋白質組學水平上探究銀屑病機制及證型物質基礎亦有研究。郝平生等[17]通過蛋白質組學iTRAQ 技術在濕熱證銀屑患者皮損中發(fā)現(xiàn)了109 個表達異常蛋白與該銀屑病的發(fā)病相關。LUNDBERG 等[18]研究KC-Tie2 銀屑病模型小鼠的蛋白質表達變化，并在人類銀屑病中驗證這些變化的有效性，結果證明蛋白質組學方法在識別銀屑病中差異調節(jié)的新肽/蛋白質方面的實用性，這些肽/蛋白質有望作為自身抗原的來源為銀屑病治療提供新的靶點。

3 基因組學在銀屑病研究中的應用

早期銀屑病的遺傳學研究尤其銀屑病易感基因研究，主要針對銀屑病發(fā)病過程中的候選基因，探究可能發(fā)揮作用的S100A7A、TNF-α等基因關聯(lián)性。該方法樣本量較少、統(tǒng)計效率低、等位基因頻率差別較大。而后，基于家系的全基因組連鎖掃描方法誕生，通過研究人類DNA 序列中短串聯(lián)重復序列與銀屑病的關聯(lián)性發(fā)現(xiàn)了銀屑病易感區(qū)域。全基因組關聯(lián)研究（GWAS）已將40 個易感位點與銀屑病重復關聯(lián)。其中，PSOR1、IL12B銀屑病易感基因及5q33.1 銀屑病易感區(qū)域已被證實。ZUO 等[19]對42 760 例銀屑病患者進行了大規(guī)模全外顯子序列分析，在15 個與銀屑病相關的新基因/位點中發(fā)現(xiàn)16 個SNP，增加了銀屑病的遺傳危險因素的數(shù)量，并突出了銀屑病中新的、可信的生物學途徑。STUART 等[20]為了辨別銀屑病患者與銀屑病關節(jié)炎患者遺傳風險因素的差異，對1 430 例銀屑病關節(jié)炎患者和1 417 例無癥狀對照受試者進行了GWAS，并對其他3 個GWAS 研究和2 個靶向基因分型研究進行Meta 分析，檢測到10 個與銀屑病關節(jié)炎相關的區(qū)域和11 個與銀屑病相關區(qū)域。這些結果為銀屑病與銀屑病關節(jié)炎之間致病相似性和差異研究提供了依據(jù)。

近年來，研究人員通過RNA 測序技術成功地確定了銀屑病的關鍵基因[21]。除此之外，有研究者建立了與銀屑病相關的基因和遺傳標記的綜合數(shù)據(jù)庫dbGAPs[22]，提供了較為全面的銀屑病靶標蛋白相關基因、遺傳途徑及基因功能，為銀屑病發(fā)病機制研究提供重要思路。

4 表觀遺傳學在銀屑病研究中的應用

隨著基因組學對銀屑病研究的日趨成熟，全基因組已經鑒定了60 多個銀屑病易感基因，但這只能解釋銀屑病遺傳能力的三分之一。銀屑病是一種多基因疾病，除了遺傳易感因素，還有環(huán)境等表觀遺傳因素也在其中起作用。表觀遺傳學主要從DNA 甲基化、非編碼RNA 調控及組蛋白修飾層面來調控基因的表達，受環(huán)境暴露、生活方式及年齡的影響?？茖W工作者借助全基因測序的思路，建立了表觀遺傳組學的新概念和新技術，試圖在這個水平上來尋找疾病的線索。近年來越來越多的證據(jù)證明表觀遺傳學與銀屑病的發(fā)病有一定相關性。

DNA 甲基化在基因表達調控，細胞增殖、分化，發(fā)育及基因組印記和X 染色體失活中均起重要作用。ADITI 等[23]研究了具有不同組織病理學特征的銀屑病患者，與鄰近正常皮膚組織的全基因組DNA甲基化譜對比，發(fā)現(xiàn)了幾個新的差異甲基化區(qū)域。不同甲基化的CpGs 在銀屑病易感區(qū)（PSORS）顯著富集，并且在表觀遺傳學水平調節(jié)關鍵致病基因的表達。HLA-Cw*0602 是銀屑病的重要遺傳標志物，TANG 等[24]比較114 例尋常型銀屑病患者中的42 個HLA Cw*0602 攜帶者和72 例非攜帶者的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)位于基因體和CpG 島的甲基化位點更可能影響HLA-Cw*0602 攜帶者的甲基化水平。ZHOU等[25]首次基于DNA 甲基化數(shù)據(jù)對中國漢族人群進行銀屑病亞類劃分，將114 例銀屑病患者根據(jù)DNA 甲基化數(shù)據(jù)分為3 個亞類，對銀屑病易感基因DEFB4、IL22、LCE3C在3 個亞型中的臨床特征和拷貝數(shù)變異（CNVs）開展研究。毛旭華等[26]檢測46 例尋常性銀屑病患者和28 例健康志愿者表皮中DNA 甲基化轉移酶（DNMT2 和DNMT3a）mRNA 表達，發(fā)現(xiàn)尋常性銀屑病表皮DNMT2 和DNMT3a mRNA 均異常高表達，且皮損高于非皮損，非皮損高于健康人群。組蛋白乙?；揎椧矃⑴c銀屑病的發(fā)病。ZHANG 等[27]發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病患者外周血單個核細胞中存在廣泛組蛋白H4 乙?；?，組蛋白H4 乙?；潭扰cPASI評分呈負相關。銀屑病非編碼RNA 調控研究主要集中在microRNA 水平，近年來長鏈非編碼RNA（lncRNA）的研究也不斷興起。目前研究已發(fā)現(xiàn)超過250 個microRNA 在銀屑病皮損或血液中異常表達，且不同microRNA 作用的靶點及涉及的信號通路不盡相同[28]。

5 腸道微生物組學在銀屑病研究中的應用

胃腸道內微生物豐富，并與宿主保持共生或拮抗的動態(tài)平衡，正常生理狀態(tài)下，宿主和細菌之間相互作用，如有益的微生物群合成了多種蛋白質和維生素供宿主利用，它們定植于胃腸道黏膜和腔體內，有效阻止病原微生物的入侵和繁殖，并能通過對機體免疫環(huán)境的刺激增強機體細胞及體液免疫效應機制。反之，微生物群落數(shù)和菌量活性發(fā)生異?；蚨ㄎ晦D移，出現(xiàn)菌群失調，則直接或間接對機體產生致病影響[29]。

腸道菌群紊亂易引發(fā)全身性炎癥機制，越來越多的證據(jù)提示，腸道菌群紊亂也參與銀屑病的慢性復發(fā)病程，銀屑病患者的腸道菌群種類和菌群數(shù)量發(fā)生改變，擬桿菌門的副擬桿菌屬、厚壁菌門的普拉梭菌等在銀屑病患者腸道中顯著降低，以上菌種在銀屑病患者皮損部位存在異常[30]，通過DNA 檢測銀屑病皮損區(qū)優(yōu)勢菌為厚壁菌門、放線菌門及變形菌門，其中厚壁菌門較正常皮膚增多，放線菌門較正常皮膚減少，也說明了腸道菌群與皮損的相關性。已有研究[31]探究戊糖乳桿菌GMNL-7 對類銀屑病小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)該菌作用后小鼠紅斑、鱗屑及表皮增厚等嚴重程度均比未用戊糖乳桿菌小鼠有明顯好轉。SKROZA 等[32]從流行病學的角度探討克羅恩病、潰瘍性腸炎與銀屑病的相關性，并借銀屑病和炎性腸病發(fā)病時的基因靶點相似性及免疫調控機制特征進一步研究發(fā)現(xiàn)銀屑病發(fā)病與炎性腸病有相關性[33]。一方面銀屑病患者腸道結構功能異常，另一方面銀屑病患者的腸道炎癥相關炎癥細胞浸潤和抗體顯著增加，猜測銀屑病和炎性腸病可能共享免疫發(fā)病機制。由此可見，若能通過構建銀屑病和無胃腸道病變正常人的胃腸道菌群種類、數(shù)量及免疫因子數(shù)據(jù)庫，有利于從微生物角度摸索銀屑病的治療。

宏基因組學（Metagenomics）又叫稱微生物環(huán)境基因組學（microbial environmental genomics）、元基因組學，是以人體微生物群元基因組DNA 序列為研究對象，研究微生物多樣性、種群結構進化關系、功能活性相互協(xié)作關系及與宿主之間的關系。其中，元基因組即指與人類共生的全部微生物的基因總和。目前，通過454 測序法、Illumina 測序技術等較為主流的高通量測序技術，測序和篩選發(fā)現(xiàn)銀屑病和炎性腸病的易感基因存在一定的重疊[35]。故利用宏基因組學很可能發(fā)現(xiàn)與銀屑病相關有意義的DNA 序列，并找到可監(jiān)測疾病復發(fā)、疾病干預的靶點。

6 轉錄組學在銀屑病研究中的應用

轉錄組是指在RNA 水平上，生物在特定的時間和空間條件下所表達的所有基因的總和。轉錄組學研究可發(fā)掘生物在特定時期起關鍵作用的基因及基因之間的相互關系，從而篩選對疾病治療和調控有效的基因。

全基因組表達譜對銀屑病差異表達基因的探索有巨大貢獻，但該法對低豐度基因表達檢測困難，故轉錄組測序就彌補了上述缺點，擴大檢測基因范圍。竇進法[36]通過轉錄組測序研究，比較銀屑病皮損、非皮損及正常皮膚基因表達譜特征，鑒定了銀屑病皮損相關的異常表達基因，以及基因與臨床表型的關系。 周伏圣[37]在全基因組范圍內，采用IlluminaHuman 450K 芯片技術檢測了114 例銀屑病患者皮膚組織DNA 中45 萬個位點的CpG 甲基化水平，整合轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)36 個銀屑病相關基因表達與甲基化相關。

7 多組學聯(lián)合在銀屑病研究中的應用

多組學技術的聯(lián)合運用，對銀屑病研究不失為更高效的方法。在銀屑病的炎癥信號與血管損傷的研究[38]中，聯(lián)合運用無偏全血RNA 轉錄組測序、實體主動脈內外血管分析、銀屑病炎癥蛋白組學分析、免疫相關測定，能較為準確地表明免疫療法治療銀屑病具有一定的療效。生物療法是銀屑病高效治療方法，有研究者[39]通過多組學應用，探究銀屑病分層優(yōu)化相關治療中的生物標志物，評估依那西普給藥前后3 個時間點每個志愿者活檢樣本皮膚和血液的RNA 測序結果，結合血液蛋白質組學數(shù)據(jù)構建樣本相似性矩陣，計算樣本之間成對的歐幾里得距離，比較跨組織轉錄組數(shù)據(jù)，使用差異表達測試，上游調節(jié)分析，聚類技術和預測建模的組合，建立的分析框架為與銀屑病治療相關的更大的功效評估提供參考。ZHAO 等[40]系統(tǒng)整合了銀屑病生物學研究多組學數(shù)據(jù)集，包括GWAS、EWAS、組織特異性轉錄組、表達數(shù)量性狀基因座（eQTL）、基因網(wǎng)絡及生物途徑，揭示銀屑病相關基因和途徑之間的相互作用，使?jié)撛诘年P鍵調控基因更為明確。

銀屑病病因和發(fā)病機制仍是研究熱點，基因組、轉錄組、蛋白質組及代謝組技術的運用已確認部分銀屑病標志物[41]，腸道菌群與銀屑病相關的蛋白、基因及轉錄組、表觀遺傳學研究趨于熱門，多組學整合分析的研究策略，有望為銀屑病診斷、疾病預測、新型生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供更有價值的研究數(shù)據(jù)，為研究銀屑病中西醫(yī)診療的分子機制和信號通路及個體化精準醫(yī)療提供新方法。