蛇床子中總黃酮最佳提取工藝優(yōu)化及殺蟲抑菌活性研究

吳永玲，魏 景，孟銀鳳，李俊偉

（1.商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術研究院，陜西 商洛 726000）

蛇床子［Cnidium monnieri（L.）Cuss.］為傘形科植物蛇床成熟后的干燥果實，主要分布于中國華東、中南、西南、西北等地［1］?，F(xiàn)代研究表明，蛇床子中含有多種活性成分，其中以蛇床子素、香豆素及黃酮類成分為主，具有殺蟲抑菌、止癢、抗心律失常、抗血栓、抗腫瘤和骨質(zhì)疏松等藥理作用，成為國際上天然藥物開發(fā)利用的熱點［2，3］。但目前蛇床子中的主要成分及藥理研究集中在蛇床子素上［4-6］，對其中的黃酮類化合物研究報道較少。如果能進一步開發(fā)利用蛇床子中的黃酮類物質(zhì)，這對蛇床子植物的發(fā)展將具有一定現(xiàn)實意義。

同時，近些年農(nóng)作物病蟲害的防治主要依靠化學農(nóng)藥，產(chǎn)生嚴重的農(nóng)藥殘留及抗藥性問題［7，8］，而市場上商品化的生物源農(nóng)藥往往只具備一種農(nóng)用活性，給病蟲害混合發(fā)生的藥劑施用帶來諸多不便。開發(fā)兼具殺蟲抑菌活性的生物源農(nóng)藥已成為開發(fā)綠色、安全、便捷食品的必要措施［9］。

天然產(chǎn)物中有效成分的提取方法多為超聲輔助提取［10］、膜分離提取等［11］，并結合正交設計或響應面設計試驗進行優(yōu)化［12］。響應面設計在工藝優(yōu)化與混料設計上應用廣泛，具有試驗操作簡潔、模型選擇廣、預測精度高等特點［13，14］。因此，本研究采取傳統(tǒng)的乙醇浸提法，結合提取單因素分析及響應面試驗優(yōu)化，以期開發(fā)出提取率高、經(jīng)濟成本低的蛇床子總黃酮最佳提取工藝，同時對提取物的殺蟲和抑菌活性進行研究，為蛇床子植物和生物源農(nóng)藥的深層次開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料供試樣品：蛇床子果實（購自商洛市中藥材商店），試驗前烘干后粉碎備用。

主要試劑：乙醇（分析純）、蘆丁標準品、NaOH（分析純），上海阿拉丁試劑公司。

供試昆蟲：蘋果黃蚜（Hyalopterus amygdali）、朱砂葉螨（Tetranychina harti）分別采集于商洛學院蘋果樹和玉米葉上，經(jīng)商洛學院生物學院孟銀鳳博士鑒定為蘋果黃蚜、朱砂葉螨。

供試菌種：甘藍黑斑病菌（Broccoli and Purple cabbage bacterial leaf spot）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioidesPenz）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、蘋果腐爛病菌（Cytosporasp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearumSchw）及水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）均來源于西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心。

1.1.2 主要儀器BJ-300型粉碎機（廣州旭朗機械設備有限公司），S-114型電子天平（上海精科實業(yè)有限公司），SHB-IIIA型循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），UV-765B型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海雙旭電子有限公司），KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司），YXQ-LS-18SI型高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），LRH-70F型生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蛇床子總黃酮的提取精密稱取10 g烘干粉碎后的蛇床子，用無水乙醇浸泡，采用浸提法得到提取液，過濾，取上清液，得到蛇床子提取液。

1.2.2 對照品溶液的配制精密稱取120℃干燥恒重的蘆丁標準品20 mg于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度線，即得0.2 mg∕mL蘆丁對照品溶液［15］。

1.2.3 標準曲線的繪制量取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加水至5 mL，加入5% NaNO2溶液1.0 mL，混勻后放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加入4% NaOH溶液10.0 mL，加水至刻度線，搖勻，放置15 min。以第一組試劑作為空白對照，在波長510 nm處，分別測定系列濃度溶液的吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.4 總黃酮得率的測定采用硝酸鋁顯色法測定蛇床子總黃酮類物質(zhì)的含量，利用紫外可見分光光度計測定提取液在波長510 nm處的吸光度。

1.2.5 單因素試驗每組精密稱取10 g蛇床子，以黃酮得率作為評價指標，采取單因素法研究不同溶劑體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（15、20、25、30、35 min）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）和乙醇體積（50、75、100、125、150 mL）4個因素對黃酮提取率的影響，研究其中一個因素的影響時其他因素作為基礎水平。以單因素為橫坐標，提取率為縱坐標，繪出每個因素對蛇床子總黃酮得率的影響折線圖。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗綜合單因素試驗結果，每組精密稱取5 g蛇床子，采用Box-Behnken因素設計試驗，以蛇床子總黃酮提取率為評價指標，選取影響黃酮提取率較顯著的因素，優(yōu)化蛇床子黃酮類物質(zhì)提取工藝條件（表1）。采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

表1 Box-Behnken設計因素及水平

1.2.7 殺蟲活性測定試驗采用梯度稀釋法，將蛇床子提取物分別稀釋為100.0、10.0、1.0 mg∕mL的供試藥劑進行殺蟲活性測定。

1）對蘋果黃蚜的毒殺活性測定［16］

采用浸蟲浸葉法：將帶有蘋果黃蚜的蘋果葉片采下，挑選大小基本一致、健康的無翅成蚜作為試蟲，用毛筆剔除不合格蟲體，每片葉上至少保留30只蚜蟲，將帶有試蟲的葉片在配好的藥液中浸漬3～5 s取出，濾紙吸干蟲體及葉片周圍的多余藥液，處理后的葉片置于9 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中預先鋪上濾紙保濕，每處理重復3次，每次重復30頭試蟲。滴水保濕，24 h后檢查試蟲死亡數(shù)（毛筆輕觸蟲體，不動即視為死亡），以0.5%表面活性劑（吐溫-80）水溶液作為空白對照，計算死亡率以及校正死亡率。計算公式如下所示。

2）對朱砂葉螨的毒殺活性測定［17］

采用玻片浸漬法：先將雙面膠一面貼在潔凈的載玻片上1∕3處，用毛筆挑取活動力強、個頭一致的成螨，使其背部粘于貼有雙面膠的載玻片上。粘貼時要注意使蟲體肢體朝上、背部粘膠，螨足可自由活動。每玻片粘朱砂螨40頭，2 h后鏡檢觀察，剔除不合格蟲體，每玻片至少保留30頭。將粘有朱砂葉螨的載玻片浸入供試藥劑中3～5 s后取出，濾紙吸去玻片周圍多余藥液，以0.5%表面活性劑（吐溫-80）水溶液作為空白對照，每處理重復3次，24 h后檢查并統(tǒng)計死蟲數(shù)，計算死亡率和校正死亡率。

采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan's新復極差法（DMRT）進行差異顯著性分析，并計算蛇床子提取物對2種試蟲的毒力回歸方程、致死中濃度（LC50）及95%置信區(qū)間。

1.2.8 抑菌活性測定試驗蛇床子總黃酮提取液對7種植物病原菌的抑制率和EC50采用生長速率法進行測定［18，19］。配制濃度為10 000 μg∕mL的蛇床子總黃酮母液，取1 mL母液加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中混合均勻即制成100 mg∕L含藥培養(yǎng)基，然后分別將菌餅接種到含藥培養(yǎng)基上，重復3次，設置空白對照，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測得供試菌的生長直徑，計算抑菌率。根據(jù)抑菌率的結果選擇合適的濃度進行倍半稀釋，配制系列濃度含藥溶液，再采用生長速率法對7種病原菌進行抑菌率測定，求出毒力回歸方程，并計算EC50。抑菌率計算公式如下所示。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

所得標準曲線方程y=2.251x+0.001 6。因R2=0.992 1接近1，表明蘆丁濃度與吸光度二者之間線性關系良好。

2.2 單因素試驗考察結果

單因素試驗中各因素對蛇床子總黃酮得率的影響見圖1。

2.2.1 溶劑濃度對蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1a可知，總黃酮得率在乙醇體積分數(shù)為50%～60%時增加較快，最大值為9.22%。當乙醇體積分數(shù)大于60%后總黃酮類物質(zhì)的得率逐漸下降，這可能與脂溶性物質(zhì)溶解量有關。因此，可以確定60%為超聲提取蛇床子總黃酮的最佳溶劑體積分數(shù)。

圖1 單因素試驗中各因素對蛇床子總黃酮得率的影響

2.2.2 提取時間對蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1b所示，在提取時間為15～25 min時黃酮提取率呈上升趨勢，黃酮得率最大為13.56%。25 min后總黃酮得率逐漸下降，這可能是因為超聲時間越長，蛇床子和乙醇溶液接觸越充分以致總黃酮類化合物溶出較多，已溶出的黃酮類物質(zhì)可能會隨其他大分子溶出或降解，故蛇床子總黃酮類物質(zhì)的最佳提取時間為25 min。

2.2.3 提取溫度對蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1c所示，提取溫度為40～60℃時，蛇床子總黃酮的得率逐漸增大，且黃酮得率最大為6.64%。當溫度高于60℃時開始下降，這可能與蛇床子中黃酮類物質(zhì)的結構隨溫度升高而破壞有關，故蛇床子總黃酮最佳提取溫度應為60℃。

2.2.4 溶劑體積對蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1d所示，在溶劑體積為50～100 mL時黃酮提取率呈上升趨勢，黃酮得率最大為23.88%。溶劑體積大于100 mL后黃酮得率逐漸下降，這可能是因為溶劑體積越大時，溶液與之接觸越充分，導致其他大分子物質(zhì)溶出，使黃酮類物質(zhì)提取率降低，故蛇床子總黃酮類物質(zhì)的最佳提取溶劑體積為100 mL。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析綜合單因素試驗結果，選擇Design-Expert V 8.0.6.1執(zhí)行Box-Behnken中心組合設計模型，固定提取溫度為60℃，以蛇床子黃酮得率（Y）與溶劑體積分數(shù)（A）、提取時間（B）、溶劑體積（C）建立回歸模型，對表2中響應面試驗結果進行多次回歸擬合，得到回歸方程：Y=7.72-1.09A+0.29B-1.72C-0.22AB+0.81AC+0.65BC-2.29A2-1.84B2-1.23C2。

表2 蛇床子黃酮提取率響應面試驗設計

由表3所示，模型達到極顯著水平（回歸模型P＜0.000 1），同時方程失擬項P=0.115 5，表明模型選擇可靠、預測值與實際值相差不大，故可用此模型分析和預測影響蛇床子中黃酮提取率的3個因素變化規(guī)律。從模型顯著水平可以得出，蛇床子黃酮提取率的影響因素為：C（溶劑體積）＞A（溶劑體積分數(shù)）＞B（提取時間），表明這3個因素均與蛇床子黃酮提取率有一定相關性，其中溶劑體積對蛇床子黃酮提取率的影響極顯著。

表3 回歸模型的方差分析

將模型中A、B和C3個因素在方差分析的基礎上固定在中間水平上，蛇床子黃酮的得率作為響應指標［20］，得出其他2個因素交互作用蛇床子黃酮提取模型，并根據(jù)該模型繪制3D圖。等高線彎曲程度則反映了2因素之間的交互作用大?。?1］，如圖2所示，溶劑體積分數(shù)與溶劑體積、溶劑濃度與提取時間兩兩交互作用對提取率的影響較大，而溶劑體積與提取時間作用并不明顯。在3D圖中的最高點可以得到一個理論最大值，這與方差分析結果一致。

圖2 2因素相互作用影響蛇床子總黃酮得率的響應面效果

2.3.2 最佳工藝條件的確定及驗證按照蛇床子總黃酮響應面法的試驗結果，得到最佳提取條件下總黃酮得率預測值為7.716%，即溶劑體積分數(shù)為63.78%，提取時間為23 min，溶劑體積為84.44 mL?？紤]實際可操作性，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為溶劑體積分數(shù)64%、提取時間23 min、溶劑體積85 mL，最終黃酮實際得率為7.83%，預測值與實測值差異不大，且工藝穩(wěn)定性在重復性試驗下證明有一定可靠性，表明此響應面優(yōu)化法對蛇床子總黃酮的提取有參考價值。

2.4 殺蟲活性測定結果

蛇床子提取物對2種試蟲的觸殺活性見表4。分別采用浸蟲浸葉法和玻片浸漬法測定蛇床子提取物對蘋果黃蚜和朱砂葉螨的觸殺活性，結果表明蛇床子提取物對2種試蟲均有一定的觸殺活性，且校正死亡率隨提取物濃度的增大而升高。當蛇床子提取物濃度為100.0 mg∕mL時，對2種試蟲的48 h校正死亡率均為100%，在最小濃度1.0 mg∕mL時，對2種試蟲的的48 h校正死亡率均大于50%，但此濃度下24 h校正死亡率分別為37.86%和28.16%，觸殺活性一般。在10.0、1.0 mg∕mL濃度下2種試蟲的同一時間校正死亡率存在顯著差異，整體來看，蛇床子提取物對蘋果黃蚜的觸殺活性優(yōu)于朱砂葉螨。

表4 蛇床子提取物對2種試蟲的觸殺活性

為進一步探討蛇床子提取物對2種試蟲的毒力大小，分別測試并求出2種試蟲24、48 h下的致死中濃度和毒力回歸方程。由表5可知，蛇床子提取物48 h對蘋果黃蚜的毒力最強，致死中濃度（LC50）為0.041 mg∕mL，大于對朱砂葉螨的毒力（LC50為0.086 mg∕mL）。由此可見，蛇床子提取物對蘋果黃蚜和朱砂葉螨均表現(xiàn)出一定的毒力，對蘋果黃蚜的毒力大于朱砂葉螨。

表5 蛇床子提取物對2種試蟲的毒力測定

2.5 抑菌活性測定結果

從表6可以看出，蛇床子提取物對7種病原菌的生長均有抑制作用，且抑菌活性不同菌種間存在較大差異。其中蛇床子提取物對番茄灰霉病菌EC50為21.29 mg∕L，抑制活性最好；對蘋果腐爛病菌和油菜菌核病菌的EC50分別為35.56、32.27 mg∕L，抑制作用較強；對其他4種植物病原菌的抑制活性較差，EC50均大于45.00 mg∕L。蛇床子提取物對這7種植物源病菌的抑制活性從高到低依次為番茄灰霉病菌＞油菜菌核病菌＞蘋果腐爛病菌＞蘋果炭疽病菌＞甘藍黑斑病菌＞小麥赤霉病菌＞水稻紋枯病菌。

表6 蛇床子黃酮提取物對7種供試真菌的抑制毒力測定

3 小結

本研究通過浸提法結合響應面法優(yōu)化單因素試驗的提取工藝，對蛇床子中的黃酮含量進行了測定，確定最佳提取工藝條件：溶劑無水乙醇體積分數(shù)為64%，提取時間為23 min，體積為85 mL。最終黃酮實際得率為7.83%，且實際值與理論值差異不大。

采用浸蟲浸葉法和玻片浸漬法測定蛇床子提取物對蘋果黃蚜和朱砂葉螨的觸殺活性，結果表明，蛇床子提取物濃度為1.0 mg∕mL時，對2種試蟲的48 h校正死亡率均大于50%；濃度為10.0、1.0 mg∕mL時，對2種試蟲的校正死亡率存在顯著性差異。同時，蛇床子提取物對蘋果黃蚜和朱砂葉螨均表現(xiàn)出一定的毒力，48 h的LC50分別為0.041、0.086 mg∕mL。此外，抑菌活性試驗表明，蛇床子提取物對番茄灰霉病菌的抑制活性最好，對蘋果腐爛病菌和油菜菌核病菌也具有較強的抑菌活性。

目前農(nóng)作物病蟲害的防治主要依靠化學農(nóng)藥，產(chǎn)生了嚴重的農(nóng)藥殘留和抗藥性問題［22］。本研究為生物源農(nóng)藥開發(fā)和蛇床子植物的利用提供了一定的理論依據(jù)，但同時本試驗中殺蟲抑菌活性均是在室內(nèi)條件下進行，與田間試驗結果之間可能存在一定差異［23］，關于蛇床子提取物在田間實際環(huán)境因素中的農(nóng)用活性還有待于進一步研究。