豬生物育種研究進(jìn)展

李月明，畢延震

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所∕動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072）

生豬產(chǎn)業(yè)關(guān)乎民生大計(jì)，對(duì)促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)平穩(wěn)發(fā)展、保障糧食安全和提高居民生活水平具有重要意義。中國(guó)是生豬養(yǎng)殖與消費(fèi)大國(guó)，截至2019年，生豬存欄與出欄數(shù)分別占世界總量的55.78%和45.08%。然而，種豬進(jìn)口依然是目前中國(guó)改善生豬生產(chǎn)性能的重要方式，大量進(jìn)口外國(guó)豬種導(dǎo)致中國(guó)地方豬數(shù)量急劇下降，對(duì)中國(guó)生豬育種和養(yǎng)殖的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展十分不利［1］?？朔袊?guó)生豬育種所存在的問(wèn)題，充分發(fā)揮地方豬肉質(zhì)好、繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性好等獨(dú)特的種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)，是提高中國(guó)豬種國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)生豬育種可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路［2］。隨著豬種全基因組測(cè)序的完成，基礎(chǔ)研究的不斷深入，越來(lái)越多基因功能被注釋?zhuān)N水平也從群體水平過(guò)渡到分子水平?；蚓庉嫾夹g(shù)因其精準(zhǔn)性與高效性脫穎而出，成為優(yōu)勢(shì)豬種選育的一把“利器”。在實(shí)際育種工作中，聯(lián)合雜交育種、分子標(biāo)記輔助育種以及全基因組選擇育種等方法不僅可以突破技術(shù)壁壘，還將大大縮短育種時(shí)間，結(jié)合胚胎工程技術(shù)促進(jìn)優(yōu)勢(shì)個(gè)體的擴(kuò)繁，也將不斷推進(jìn)育種進(jìn)程［3］。本文對(duì)豬生物育種技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，并綜述基因編輯技術(shù)在豬產(chǎn)肉性能、改善豬肉品質(zhì)、提高飼料轉(zhuǎn)化率以及抗病性上的育種進(jìn)展，預(yù)測(cè)基因編輯技術(shù)和重大基因在未來(lái)豬育種工作中的應(yīng)用。

1 豬生物育種技術(shù)發(fā)展概述

生物育種是指利用遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)理論以及現(xiàn)代生物工程技術(shù)培育生物新品種的過(guò)程。常規(guī)的育種技術(shù)是包括雜交育種、分子標(biāo)記輔助育種和全基因組選擇育種等在內(nèi)的技術(shù)和方法，在以往的優(yōu)良豬種選育工作中被廣泛應(yīng)用并卓有成效，但這些技術(shù)也存在明顯不足。雜交育種可集中親本的優(yōu)良性狀，但育種時(shí)間漫長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣；分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)具有分子標(biāo)記數(shù)量豐富和可操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但一些與目標(biāo)基因相連鎖的分子標(biāo)記仍缺乏進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證，導(dǎo)致結(jié)果的可信度不足［4］；相比于分子標(biāo)記輔助育種，全基因組關(guān)聯(lián)分析通過(guò)對(duì)難以測(cè)定和選擇的性狀進(jìn)行分析來(lái)控制選配、減少群體近交等問(wèn)題，早期選擇準(zhǔn)確率更高，但價(jià)格昂貴，而且分子輔助標(biāo)記和基因組選擇技術(shù)僅用物種自身基因來(lái)改良品種，不對(duì)外源基因加以利用［5］；基因工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以跨越物種界限導(dǎo)入外源基因或通過(guò)基因沉默獲得優(yōu)勢(shì)性狀，中國(guó)的生豬育種在該育種技術(shù)上取得了一定進(jìn)展，但存在隨機(jī)插入風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)生脫靶效應(yīng)問(wèn)題［6］。因此，僅用以往的育種方法無(wú)法滿(mǎn)足當(dāng)下的實(shí)際育種需要。

隨著鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列∕Cas9系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs∕Cas9）基因編輯技術(shù)的發(fā)展，人類(lèi)對(duì)基因功能的研究更加深入，從而進(jìn)一步提高了生豬的育種效率，加快了育種進(jìn)程［7］。以CRISPRs∕Cas9為代表的基因編輯技術(shù)從遺傳學(xué)角度上選育優(yōu)勢(shì)豬種，相比于ZFNs和TALENs具有識(shí)別位點(diǎn)多樣、成功率高、操作簡(jiǎn)單、周期短和成本低等優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)植物新品種的培育、構(gòu)建動(dòng)物模型和基因治療等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［8］。不僅如此，CRISPR∕Cas9系統(tǒng)與Cre∕LoxP系統(tǒng)相結(jié)合可以刪除標(biāo)記基因，降低對(duì)人類(lèi)基因組的潛在影響［9］。基于CRISPR∕Cas9系統(tǒng)的單堿基編輯技術(shù)利用CBE4和ABE4編輯器，可以將單核苷酸變異引入基因組，在不發(fā)生雙鏈斷裂的條件下產(chǎn)生永久的DNA編輯，提高基因編輯的生物安全性［10，11］。基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新將在家畜育種工作中發(fā)揮更大的作用。

2 豬經(jīng)濟(jì)性狀育種進(jìn)展

2.1 提高產(chǎn)肉性能

隨著生活水平的日益提高，人們對(duì)豬肉的需求量不斷上升。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布數(shù)據(jù)，2020年豬肉總產(chǎn)量為4 113萬(wàn)t，而中國(guó)全年豬肉需求量約5 500萬(wàn)t，豬肉供給依然存在較大的缺口［12］。胴體與肉質(zhì)是衡量養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要指標(biāo)，同時(shí)也是開(kāi)發(fā)地方豬種需要考慮的重要因素。肌抑制素（Myostatin，MSTN）是骨骼肌生長(zhǎng)的經(jīng)典負(fù)控因子。利用CRISPR∕Cas9系統(tǒng)對(duì)敲除MSTN的雙等位基因，大大提高了巴馬豬、兩廣小花豬和二花臉豬等地方豬的瘦肉率［13-15］。激活素A可以促進(jìn)MSTN的表達(dá)，分別沉默雞和山羊的激活素A受體IIB型（Activin receptor type IIB，ACVR2B），可以引起其肌肉含量顯著升高，該基因?yàn)榧∪獾呢?fù)調(diào)節(jié)因子，敲除該基因可以作為提高豬產(chǎn)肉性能的一種選擇［16，17］。研究表明，解偶聯(lián)蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）是線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的載體，在棕色脂肪組織的非顫抖性產(chǎn)熱中起著重要作用。缺乏UCP1會(huì)使仔豬溫度調(diào)節(jié)能力變差以及脂肪沉積增加，利用CRISPR∕Cas9系統(tǒng)獲得UCP1-KI豬，UCP1-KI豬的脂肪溶解增加、沉積減少，使之更符合現(xiàn)代人的飲食習(xí)慣［18，19］。

2.2 改善豬肉品質(zhì)

對(duì)于豬肉品質(zhì)的廣泛評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括肉的外觀(guān)、適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，肌肉組織結(jié)構(gòu)的肌纖維發(fā)育與肌內(nèi)脂肪的沉積決定了肉質(zhì)的肉色、嫩度、風(fēng)味、多汁性和系水力等關(guān)鍵指標(biāo)［20］。表達(dá)Fat-1和Fat-2的轉(zhuǎn)基因豬，豬肉中ω-3和ω-6的含量顯著提高，為人們提供了一種富含多不飽和脂肪酸的新豬肉品種［21］。過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是肌內(nèi)脂肪生成和脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，PPARγ過(guò)表達(dá)的大白豬肌內(nèi)脂肪顯著增加，在保證瘦肉占比不變的情況下，豬肉的口感更為豐富［22］。豬肉貯藏是影響豬肉品質(zhì)和食品安全的重要因素，鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，是鈣蛋白酶的特異性抑制劑，在冷藏條件下肉類(lèi)宰后貯藏過(guò)程中起關(guān)鍵作用［23］。CAST在成年豬的表達(dá)量顯著增高，對(duì)于豬的肌肉剪切力和嫩度具有調(diào)控作用，該基因可以為豬肉品質(zhì)性狀的優(yōu)化育種工作提供參考［24］。豬脂肪干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞中的全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析表明，KLF6是脂肪形成的正調(diào)控因子，KLF6下調(diào)后脂滴形成顯著下降，可用于減少豬的整體脂肪量，促進(jìn)低脂肪豬的育種［25，26］。Zhang等［27］通過(guò)對(duì)2 448頭豬背最長(zhǎng)肌脂肪酸組成相關(guān)的32個(gè)性狀進(jìn)行全基因組SNP位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)ELOVL6、SCD和FASN具有顯著位點(diǎn)，為脂肪酸成分和其他經(jīng)濟(jì)特征的共同遺傳控制提供了新的見(jiàn)解，并為提高豬肉中的不飽和脂肪酸提供了相關(guān)基因策略。

2.3 提高飼料轉(zhuǎn)化效率

飼料成本占養(yǎng)豬成本的70%，提高飼料轉(zhuǎn)化率是降低養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)成本和減少環(huán)境污染的有力手段。飼料轉(zhuǎn)化率的主要影響因素除了飼料本身和環(huán)境因素，還包括豬自身的身體組分和新陳代謝。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)生物育種技術(shù)獲得表達(dá)特定酶類(lèi)的豬種是對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用更充分的有效途徑。在腮腺中表達(dá)木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬相比，糞便中的粗蛋白含量降低了15.5%，提高了總能量和粗蛋白的消化率［28］。表達(dá)β-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶的轉(zhuǎn)基因豬，比野生型豬的糞便氮和磷含量減少23.2%～45.8%，生長(zhǎng)速度和育肥出欄速度更快［29］。此外，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究和轉(zhuǎn)錄組分析，圍繞重要的SNP分布發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)飼料轉(zhuǎn)化率的候選 基 因 包 括TPH2、FAR2、IRAK3、YARS2、GRIP1、FRS2、CNOT2和TRHDE。TPH2具有調(diào)節(jié)豬腸道活力的潛力，GRIP1可能通過(guò)影響豬的食欲來(lái)調(diào)節(jié)飼料轉(zhuǎn)化率，GRIP1、FRS2、CNOT2和TRHDE可通過(guò)甲狀腺激素信號(hào)通路調(diào)節(jié)各種組織的新陳代謝［30］。利用基因編輯技術(shù)驗(yàn)證上述候選基因的功能和有效性，可以增進(jìn)對(duì)影響豬飼料轉(zhuǎn)化率遺傳機(jī)制的深入了解，有利于優(yōu)化節(jié)糧環(huán)保型豬的育種方案。

3 豬抗病育種進(jìn)展

傳染性疾病是豬規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的最大威脅，誤食患病豬肉也會(huì)對(duì)消費(fèi)者造成極大的安全隱患。就目前而言，大多數(shù)疾病多以預(yù)防為主，疫苗接種是主要的預(yù)防方式，但該方法成本高、效用有限、消耗大量人力和物力。基因編輯技術(shù)可致力于傳染性疾病致病機(jī)理的研究，為選育和改造出具有抗病性狀的優(yōu)質(zhì)種豬提供更好的方案。

豬的藍(lán)耳病又稱(chēng)為豬繁殖與呼吸綜合征，其病原為豬生殖和呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），母豬感染后出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病、流產(chǎn)和死胎。CD163是該病毒的受體，利用CRISPR∕Cas9系統(tǒng)敲除母豬基因組上的CD163，母豬可免受PRRSV的感染，同時(shí)對(duì)于沒(méi)有敲除CD163的胎兒也具有子宮內(nèi)保護(hù)作用［31］。僅敲除CD163的SRCR5結(jié)構(gòu)域的兩廣小花豬和大白豬可以完全抵御PRRSV-2、JXA1和MY病毒株的感染，在攻毒試驗(yàn)中未出現(xiàn)臨床癥狀、病理異常、病毒血癥和PRRSV抗體［32］。研究表明，CD163可與宿主蛋白鈣蛋白酶-1相互作用，鈣蛋白酶-1可以促進(jìn)病毒的脫包被，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)建立商品化的PRRSV抗性豬系以及進(jìn)一步研究病毒感染的宿主基因位點(diǎn)提供 了 參 考［33］。CD163和pAPN雙基因敲除豬 對(duì)PRRSV和豬三角病毒均具有絕對(duì)抗性，為感染機(jī)制的研究引入了一個(gè)有價(jià)值的模型［34］。除此之外，雙crRNAs組 合靶 向PRRSV的ORF5和ORF7的mRNA可以完全清除病毒感染，該方法可以作為一種有效的抗病毒策略［35］。

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）為正鏈RNA病毒，基因組大小約8.5 kb，是豬口蹄疫的病原，對(duì)全球偶蹄動(dòng)物具有高度傳染性［36］。組織蛋白酶S（Cathepsin S，CTSS）具有抑制病毒復(fù)制的作用。過(guò)表達(dá)CTSS能夠抑制FMDV-O在PK-15細(xì)胞中復(fù)制［37］。研究表明，草莓缺口同源物2（Strawberry notch homolog 2，SBNO2）在細(xì)胞中參與炎癥反應(yīng)，敲除BHK-21細(xì)胞系的SBNO2基因，有抑制FMDV復(fù)制的作用［38］。解旋酶DDX23可以參與pre-mRNA剪接，對(duì)FMDV核糖體進(jìn)入位點(diǎn)依賴(lài)性翻譯產(chǎn)生負(fù)向影響，過(guò)表達(dá)DDX23可以降低FMDV的復(fù)制，對(duì)抗FMDV感染的研究具有一定的參考價(jià)值［39］。

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬急性傳染病，病死率高達(dá)100%，能夠致使仔豬腹瀉嘔吐，妊娠母豬流產(chǎn)死胎等癥狀，嚴(yán)重影響了全球豬養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益與發(fā)展。研究表明，RSAD2對(duì)DNA和RNA病毒均具有抗病毒活性，體外攻毒試驗(yàn)表明RSAD2的位點(diǎn)特異性整合可以有效減少PRV和典型豬瘟病毒感染［40］。膜蛋白Nectin1和Nectin2被認(rèn)為是PRV感染的受體，單個(gè)基因敲除后的PK-15細(xì)胞相較于野生型細(xì)胞而言，PRV感染顯著減少，該方法可以用于豬的抗PRV育種研究［41］。PRV感染后，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，Caspase-1穩(wěn)定敲除的PK-15細(xì)胞可以抑制PRV的復(fù)制，并且細(xì)胞活力不受影響［42］。除此之外，敲除PK-15的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白基因也能夠抑制PRV的增殖，并且能夠顯著抑制子代病毒的增殖能力［43］。與之相反，TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）在抗病毒天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。TBK1穩(wěn)定敲除的PK-15細(xì)胞系可以促進(jìn)PRV復(fù)制［44］。敲除豬肺巨噬細(xì)胞系的干擾素基因刺激因子基因同樣能夠促進(jìn)PRV在細(xì)胞中復(fù)制，這些研究促進(jìn)了豬種抵御PRV感染分子機(jī)制的研究［45］。

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原［46］。SYNGR2主要在神經(jīng)元細(xì)胞突觸囊泡膜中表達(dá)，PCV2在SYNGR2敲除的PK-15細(xì)胞中病毒量降低，為SYNGR2參 與 促進(jìn)PCV2感染提供依據(jù)［47］。PCV2的衣殼蛋白是一種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)制過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。PCV2的衣殼蛋白可以直接與NAP1L4的124-279位的氨基酸殘基發(fā)生相互作用，過(guò)表達(dá)NAP1L4會(huì)導(dǎo)致PCV2的衣殼蛋白表達(dá)下調(diào)，病毒滴度降低，而敲除NAP1L4后PCV2的基因組DNA拷貝數(shù)和病毒滴度增加［48］。PCV2衣殼蛋白的泛素化降解是抑制病毒復(fù)制的有效手段。pMKRN1是一種E3連接酶，可以通過(guò)泛素化降解PCV2衣殼蛋白，過(guò)表達(dá)pMKRN1可以減少衣殼蛋白和病毒復(fù)制，有助于PCV抗病豬的育種工作研究和對(duì)pMKRN1的抗病機(jī)制的進(jìn)一步了解［49］。以上研究策略也可用于開(kāi)展對(duì)非洲豬瘟、豬流感和細(xì)小病毒等其他疾病的研究，從而獲得具有抗病能力的育種新材料，在增強(qiáng)種豬抗病性的同時(shí)大大減小了飼料藥物添加劑的濫用，從而實(shí)現(xiàn)生豬育種的可持續(xù)發(fā)展。

4 討論

針對(duì)中國(guó)目前的種豬育種存在的外來(lái)引種占比高、育種創(chuàng)新性不足這一現(xiàn)狀，育種科研單位和養(yǎng)豬企業(yè)等應(yīng)更加重視生豬育種問(wèn)題，挖掘和利用中國(guó)生豬品種的遺傳資源以加強(qiáng)育種創(chuàng)新性，進(jìn)一步提升中國(guó)豬種的核心競(jìng)爭(zhēng)力。在技術(shù)層面，盡管基因編輯等技術(shù)在育種過(guò)程中存在需要改進(jìn)的地方，但在各個(gè)方面均展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。加大生物育種技術(shù)研發(fā)的投入力度，使其朝著更加精準(zhǔn)、高效、安全、經(jīng)濟(jì)的方向不斷創(chuàng)新。在完善育種和遺傳評(píng)估體系上要做到“在研究上要大膽，推廣上要慎重，管理上要嚴(yán)格”［50］?；蚓庉嫾夹g(shù)將推動(dòng)基礎(chǔ)科學(xué)研究的迅猛發(fā)展，也將在促進(jìn)家畜的繁殖、生長(zhǎng)和抗病等育種工作上發(fā)揮重要作用，在構(gòu)建動(dòng)物疾病模型和基因治療方面前景可觀(guān)。